مقاله رایگان با موضوع رسوب گذاری

دانلود پایان نامه

گردید.
مراحل کار به شرح ذیل می‌باشد:
۱- ابتدا نمونه از فریزر خارج شد و پس از ذوب شدن یخ نمونه، از داخل میکروویال خارج و در پتری دیش قرار داده شد. با استفاده از یک تیغ استریل جراحی، به دقت نمونهی بافتی خرد شده و در یک ویال فاقد نوکلئاز قرار داده شد.
۲- به ازای هر ۵۰ تا ۱۰۰ میلی گرم از بافت، یک میلی لیتر ترایزول به ویال اضافه شد تا بافت هموژنیزه گردد. پس از اضافه کردن ترایزول، در صورتیکه بافت هنوز باز نشده باشد، با پنس استریل نمونههای بافتی مجددا خرد شده و تا زمان بازشدن کامل بافت، با سمپلر به آرامی پیپت شود. پس از اینکه بافت کاملا باز شد، نمونه به مدت ۵ دقیقه در دمای آزمایشگاه (۲۵ درجه)، قرار داده شد تا جداسازی کمپلکس نوکلئوپروتئینی به طور کامل انجام شود.
۳- مرحلهی بعد، فاز جداسازی است که طی آن ۲۰۰ میکرولیتر کلروفرم اضافه کرده و به مدت ۱۵ ثانیه با دست تکان میدهیم، سپسویال به مدت ۵ دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد.
۴- در ادامه، نمونه در دمای ۴ درجه ی سانتیگراد، در دورg12000و به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شد. سانتریفیوژ سبب تشکیل سه فاز میشود: فاز رویی که فاز آبی بوده و حاوی اسیدنوکلئیک میباشد، فاز میانی که فاز پروتئینی بوده و فاز پایینی که شامل کلروفرم و ترایزول بوده است.
۵- مرحلهی بعد تشکیل شدن رسوب RNA است که طی آن به آرامی فاز آبی محتوی RNA، برداشته شده و به یک ویال دیگر منتقل شد و هم حجم مقدار انتقال یافته، الکل ایزوپروپانول اضافه شد.
۶- ویال به مدت ۱۰ دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا عمل رسوب گذاری به خوبی انجام شود. پس از آن، ویال به مدت ۱۰ دقیقه در دور g12000، در دمای ۴ درجهی سانتیگراد سانتریفیوژ شد.
۷- پس از سانتریفیوژ، دو فاز تشکیل شد: محلول سوپرناتانت و رسوب RNA. محلول سوپرناتانت بالایی که حاوی ایزوپروپانول بود از سطح رسوب RNA کشیده شد. ویال حاوی رسوب RNA به مدت ۱۰ دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا خشک شود.
۸- در انتها ۲۰ تا ۵۰ میکرولیتر آب فاقد نوکلئاز۵۹ به رسوب انتهایی ویال اضافه شد و رسوب در آب حل شد.
۳-۸-۲- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز
نانودراپ دستگاهی است که شدت نور را بصورت تابعی از طول موج اندازه گیری میکند. در حقیقت این دستگاه با استفاده از میزان جذب نور، تعیین غلظت میکند. برای بررسی خلوص RNAهای استخراج شده، میتوان از نسبت جذب نوری در طول موجهای ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر (A260/A280) استفاده کرد. این نسبت باید در بهترین حالت بین ۸/۱ تا ۲ باشد و نسبتهای کمتر نشان دهندهی آلودگی به پروتئین میباشد.
روش کار:
ابتدا با ۱ میکرولیتر آب مقطر دستگاه کالیبره شد. سپس ۱ میکرولیتر RNAی استخراج شده روی لنز دستگاه قرارداده و جذب آن در طول موج ۲۶۰ نانومتر خوانده شد. عدد خوانده شده توسط دستگاه، نشان دهندهی غلظت RNA در یک میکرولیتر میباشد. با استفاده از این غلظت مقدار RNAای که برای سنتز cDNA باید مورد استفاده قرار گیرد، محاسبه شد. براساس غلظت خوانده شده، به ‌منظور بررسی صحت استخراج RNA، از الکتروفورز ۵/۰ میکروگرم RNA مورد نظر بر روی ژل آگارز ۲/۱% استفاده شد. برای این منظور ابتدا ۲/۱ گرم پودر آگارز را در ۱۰۰ میلیلیتر بافر TAE با استفاده از حرارت حل نموده و پس از یکنواخت و همگن شدن، محلول را در ظرف مخصوص و با قرار دادن شانه در آن، ریخته و پس از بستن ژل، به آرامی شانه را از داخل ژل خارج کرده و ژل را درون تانکی که حاوی بافر TAE است قرار داده شد. سپس RNA استخراج شده با مقدار مناسبی از رنگ بارگذاری۶۰ مخلوط شد و در چاهک ژل آگارز ۲/۱% در بافر TAE تخلیه شد و در ولتاژ ۹۰ به مدت ۴۰ دقیقه الکتروفورز گردید. پس از آن، ژل به مدت ۱۰ دقیقه در ظرف حاوی اتیدیوم بروماید یک درصد رنگآمیزی و سپس با آب مقطر شستشو داده شد و در زیر نور ماوراءبنفش عکسبرداری انجام گردید و روی ژل دو باند مشاهده شد که نشان دهندهی صحتRNAهای استخراج شده بودند.
۳-۸-۳- تیمار کردن نمونههای RNAی استخراج شده
تیمارکردن نمونه های RNAی استخراج شده با DNase I صورت می پذیرد که این کار جهت حذف آلودگی ژنومی به کار میرود. مقادیر بین ۵/۰تا ۵ میکروگرم از RNA را میتوان تیمار کرد، ولی مقدار بهینهی آن ۱ میکروگرم است.
روش کار:
میزان ۱ میکروگرم از محلول RNA(بر اساس جذب خوانده شده توسط نانودراپ) برداشته شده و به یک ویال منتقل شد، سپس با مواد ذکر شده در جدول زیر ترکیب میشود.
جدول(۳-۴): مواد مورد استفاده در تیمار نمونههایRNA

نام ماده
مقدار
RNA
۱µg
DNase I
۱µl
RNase inhibitor (20 u/µl)
۱µl
DNase I buffer
۲µl

سپس جمع موارد فوق از عدد ۲۰ کم شد تا مقدار آب فاقد نوکلئاز که میبایست به این مواد اضافه میشد، به دست آید. پس از اضافه کردن مواد با یکدیگر، ویال به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد در دستگاه ترمومیکسر قرار داده شد تا عمل انکوباسیون انجام گیرد. پس از این زمان، ۲ میکرولیتر محلولEDTA61(25mM)، به ویال مذکور اضافه شد.EDTA یک کلات کنندهی فعالیت DNase I است و سبب متوقف کردن فعالیت این آنزیم میشود.پس از تیمارکردن، مجددا جذب RNA با نانودراپ خوانده شد. با کسب اطمینان از مناسب بودن غلظت RNA، از آن برای سنتز cDNA استفاده شد.
۳-۸-۴- سنتزDNA مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA
با استفاده از فرآیند نسخه برداری معکوس، رشتهی DNA از روی الگوی RNA ساخته میشود. محصول بدست آمده DNAی مکمل یاcDNA62 نام دارد. در واقع واکنش رونوشت برداری معکوس، واکنشی است که طی آن، آنزیم۶۳نسخه بردار معکوس، RNA را به cDNA تبدیل میکند.
از مقادیر ۵/۰ تا ۲ میکروگرم میتوان برای سنتز cDNA استفاده کرد، ولی مقدار بهینهی RNA برای سنتز cDNA از روی آن، ۱میکروگرم است.
روش کار:
۱- ۱ میکروگرم از RNAی تیمار شده با IDNase برداشته شده و به داخل یک ویال ۵/۱ میلی لیتری ریخته شد. سپس ۱میکرولیتر پرایمر هگزامر تصادفی۶۴، به آن افزوده شد.
۲- توسط آب فاقد نوکلئاز، حجم داخل هر ویال به ۱۲ میلی لیتر رسید.
۳- ویال به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۰ درجهی سانتیگراد قرار داده شد تا واکنش اتصال پرایمر به RNA به خوبی صورت پذیرد.سپس مجددا ویال به روی یخ منتقل شد.
۴- سپس به ویال مواد زیر اضافه شد:
جدول(۳-۵): مواد مورد استفاده در سنتزcDNA
نام ماده
مقدار
۵X Reaction buffer
۴µl
dNTP(10mM)
۲µl
RNase inhibitor
(۲۰ u/µl)
۱µl

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   مقاله درباره مفاهیم قرآنی و دیدگاه اسلام

محتویات ویال به مدت ۵ دقیقه در دمایºC25 انکوبه شد.
درنهایت به ویال، ۱ میکرولیتر از آنزیم نسخه بردار معکوس اضافه شد. این ویال، RT+ نام گرفت.
برای اطمینان از درستی انجام واکنش، ویال RT- نیز تهیه شد. درواقع ویال RT-، همهی مواد مورد نیاز جهت سنتزcDNA را داراست، با این تفاوت که به جای اضافه کردن ۱ میکرولیتر از آنزیم نسخه بردار معکوس، ۱ میکرولیتر آب فاقد نوکلئاز اضافه شده است. در نتیجه در ویال RT+، به دلیل حضور آنزیم، واکنش رونوشت برداری معکوس انجام شده وcDNA سنتز میشود، درحالیکه در ویال RT- به دلیل عدم حضور آنزیم، این واکنش انجام نمیشود.
ویالهای RT+ و RT-در دستگاه PCR قرار داده شدند و دستگاه طبق برنامه دمایی جدول ۳-۷ تنظیم گردید.
جدول (۳-۶): برنامه دمایی سنتز cDNA
تکرار هر مرحله
زمان
دما(سانتیگراد)
۱ سیکل
۱۰ دقیقه
۲۵ درجه
۱سیکل
۱۰ دقیقه
۶۰ درجه
۱سیکل
۱۰ دقیقه
۷۰ درجه

۳-۸-۵- روش انجام واکنش زنجیرهای پلی مراز ۶۵(PCR) جهت اطمینان از سنتز cDNA
مواد ذکر شده در جدول ۳-۵، داخل استریپهای۲/۰ میکرولیتری به ترتیب اضافه شد و در انتها پیپتاژ گردید (مقادیر ذکر شده در جدول به ازای یک واکنش برای انجام PCR است). پرایمر مورد استفاده، Gapdh و هم چنین الگوی cDNA افزوده شده،cDNA سنتز شده از RNA استخراج شده از بافتها بود که هر کدام شامل واکنشهای RT+ و RT- بود و در استریپهای جداگانهای تهیه شد. سپس استریپهای حاوی مواد لازم برای PCR، به داخل دستگاه ترموسایکلر منتقل شد و دستگاه طبق برنامه دمایی جدول۳-۷ تنظیم گردید. در واقع در این مرحله برای ارزیابی آلودگی احتمالی نمونه های RT- به DNA و نیز برای سنجش cDNA ساخته شده در ویالهای RT+، واکنش PCR با پرایمر اختصاصی ژن Gapdh، که یک ژن Housekeeping است، انجام شد.

جدول(۳-۷): مواد مورد استفاده در RT-PCR
مقدار (μl)
نام ماده
۱۸.۱۵
dH2O
۲.۵
PCR(10X)Buffer
۰.۷۵
MgCl2(50 M)
۰.۵
dNTP (10Mm)
۱
Forward Primer (5 pmol/μl)
۱
Reverse Primer (5 pmol/μl)
۰.۳
DNA Polymerase SmarTaq
۰.۸
cDNA (50 ng/μl)
۲۵
Total Volume
جدول (۳-۸): برنامه دمایی RT-PCR و تعداد سیکلهای هر مرحله
عملکرد هر مرحله
دما (درجه سانتی گراد)
زمان
تکرار
Initial denaturation
۹۵
۵ دقیقه
۱ سیکل
Denaturation
۹۵
۴۵ ثانیه

۳۰سیکل

Annealing
۶۰
۴۵ ثانیه

Extension
۷۲
۴۵ ثانیه

Final extension
۷۲
۱۰ دقیقه
۱ سیکل

۳-۸-۶-روش تهیهی ژل آگارز و انجام الکتروفورز
به منظور بررسی صحت قطعات محصولات PCR، از روش الکتروفورز محصولات بر روی ژل آگارز استفاده گردید.
برای ساخت ژل ۷/۱% آگارز،۹۳/۰ گرم پودر آگارز در ۵۵ میلیلیتر بافرTAE 1x 66 در ارلن حل شد و به خوبی در مایکروویو حرارت داده شد تا محلولی کاملاً شفاف به دست آید. محلول ژلی تهیه شده در سینی ژل که دارای شانه مناسب بوده، ریخته شد و به مدت ۲۰ تا ۳۰ دقیقه به حالت سکون قرار داده شد تا ژل کاملاً بسته شود. سپس با احتیاط به گونهای که چاهکهای ژل آسیب نبیند، شانه از ژل خارج گردید. سپس به همهی نمونهها به میزان ۲ میکرولیتر مایع رنگکنندهی Loading Dye افزوده شد. بعد از قرار گیری ژل در تانک پر از بافر TAE، ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه و ۱ میکرولیتر Ladder به چاهکها افزوده و دستگاه الکتروفورز بر روی ولتاژV 95 قرار داده شد، پس از گذشت حدوداً ۴۵ دقیقه، ژل به مدت ۱۵ الی ۲۰ دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده و نهایتاً پس از شستشو با آب مقطر درون دستگاه ثبت ژل گذاشته شد. عکس مورد نظر در کامپیوتر مشاهده و نهایتاً تصویر ژل ذخیره شد.
۳-۸-۷- طرز تهیهی محلولها
۱- بافر۵۰x TAE
در ابتدا، میزان ۲۴۲گرم پودر Tris-Base در ۵۰۰ میلی لیتر آب دیونیزه حل شد. سپس ۱۰۰ میلی لیتر محلول EDTA 0.5M با PH=8 و پس از آن ۵۷/۱ میلی لیتر اسیداستیک اشباع شده به آن افزوده شد. در نهایت حجم محلول با آب دیونیزه به ۱۰۰۰میلی لیتر رسید و در دمای اتاق نگهداری شد.
۲- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (۱۰mg/ml)
لازم به ذکر است که اتیدیوم بروماید ترکیبی بسیار خطرناک و سرطانزا میباشد،

دیدگاهتان را بنویسید