مقاله رایگان با موضوع استرس اکسیداتیو، گروه کنترل، اکسیداسیون چربی، اکسیداسیون

دانلود پایان نامه

موشهای بالغ میشود و چون این ژن در فشرده نمودن کروماتین نقش مهمی دارد در نتیجه شاید در مسیر اسپرماتوژنز اختلال ایجاد نماید.

فصل دوم
مروری بر مطالعات گذشته

۲-۱- مروری بر مطالعات علمی گذشته
بر طبق مطالعه محققان در سال ۲۰۰۱، مردانی که به علل ناشناخته نابارور هستند، دارای افزایش معنادار سطح ROS و کاهش آنتیاکسیدانها میباشند. در نتیجه استرس اکسیداتیو میتواند سبب ایجاد ناباروری در مردان شود( Pasqualotto, Sharma, Kobayashi, Nelson, & Agarwal, 2001).
Agarwal و همکارانش ارتباط بین ROS و آسیب DNA را در بیمارانی که تحت ۳۳ART بودند را بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که در افراد نابارور میزان آسیب DNAافزایش داشته همچنین با اندازهگیری میزان ROS مشاهده کردند که میزان ROS در این افراد افزایش معناداری یافته است(Saleh et al., 2003).
در سال ۲۰۱۴، گروهی از محققین با بررسی ارتباط بین ROS و آسیب DNA و میزان لقاح در مردان نابارور با علل ناشناخته که کاندید ICSI بودند به این نتیجه رسیدند که میزان آسیب DNA و استرس اکسیداتیو در این افراد به میزان قابل توجهی بالا میرود و همچنین میزان حاملگی این افراد از طریق ART کاهش مییابد(Wright, Milne, & Leeson, 2014).
با توجه به مطالعهای که Sikka بر روی نمونهی منی مردان که با H2O2 اینکوبه شده بود، نمونهها را از نظر پراکسیداسیون چربیها، عملکرد اسپرم، حرکت، مرفولوژی و آپوپتوز مورد ارزیابی قرار داد. نتایج حاصل، افزایش پراکسیداسیون چربیها، کاهش عملکرد اسپرم و همچنین تغییرات مرفولوژیک مانند آپوپتوز را نشان داد(Sikka, 2001).
طی مطالعهای در سال ۲۰۰۷، جهت القاء استرس اکسیداتیو در بیضه رتها از دو ماده t-BHP (-tبوتیل هیدروپراکسید)۳۴ و cHP (کومن هیدروپراکسید)۳۵ استفاده کردند. پس از یافتن میزانِ دوز کشنده LD50 در نسبتهای مختلف، هر یک از این دو ماده را به مدت دو هفته به صورت درون صفاقی تزریق کردند و به افزایش سطح ROS دربافت بیضه پی بردند. این مدل میتواند برای یافتن تغییرات حاصل از استرس اکسیداتیو مزمن روی سیستم تناسلی مردان و در نتیجه باروری آنها مورد استفاده قرار گیرد(Kumar, 2007).
در مطالعهای مشخص شده است که t-BHP در موش سبب القای مسیر آپوپتوز میشود(Kalia & Bansal, 2008). از طرفی اسپرماتوژنز در پستانداران، نیازمند برهمکنش متعادل میان تکثیر سلولهای جنسی، تمایز و آپوپتوز میباشد. مرگ برنامهریزی شده سلولهای جنسی در طول اسپرماتوژنز نقش ضروری ایفا میکند و جلوگیری از انجام آن در بیضه سبب نقص در اسپرماتوژنز و در نهایت ناباروری میگردد. مطالعات نشان میدهند که در مردان با دلایل ناباروری نامشخص، آسیبهای وارده به اسپرم توسط ROS، با افزایش آپوپتوز همراه میباشد. علاوه بر این، آپوپتوز میتواند توسط استرسها و آسیبهای سلولی القا گردد. عملکرد آپوپتوز بیضوی، به حفظ هوموستازی بافت در طول اسپرماتوژنز کمک میکند. هر عاملی که به بقا و عملکرد سلولهای جنسی آسیب برساند، مستقیما اسپرماتوژنز را تحت تاثیر قرار میدهد. بنابراین آشنایی با فرآیندهای بیضوی به ویژه القا آپوپتوز، جهت پیشبرد باروری مردان ضروری میباشد(Wang et al., 2003).
فاطمی و همکارانش به منظور ایجاد استرس اکسیداتیو در موشهای نر بالغ Balb/c، از ماده t-BHP استفاده کردند آنها بهمنظور تعیین LD50، موشها را به ۶ گروه، ۶ تایی تقسیم کرده و دوز‌های مختلفی از t-BHP، (۱۰۰، ۲۰۰، ۳۰۰، ۴۰۰، ۵۰۰ و ۶۰۰ میکرو مول به ازاء هر ۱۰۰گرم وزن بدن) را به صورت داخل صفاقی (IP)36 به هر گروه تزریق کردند پس از گذشت چهارده روز مشاهده کردند که افزایش سطحROS ، اثرات مخربی بر روی غلظت، تحرک و تعداد سلولهای زنده اسپرم میگذارد(Fatemi et al., 2013).
گروهی از محققین جهت ایجاد مدلی از استرس اکسیداتیو، نسبتهای ۱،۲،۴ میلیگرم/ لیتر از سم آرسنیک(AS2O3) را به مدت ۶۰ روز به صورت خوراکی به موش بالغ نر داده، سپس کیفیت اسپرم و اسپرماتوژنز را مورد تجزیه تحلیل قرار دادند. در مقایسه با گروه کنترل، وزن بیضه و اپیدیدیم، کیفیت اسپرم و از نظر بافتشناسی تغیراتی مشاهده شد. در این تحقیق بیان ژن Ddx3y که بر روی کروموزوم Y قرار دارد، در اسپرماتوژنز نقش مهمی دارد و در بافت بیضه بیان میشود به روش Real time PCR و وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده شد که بیان ژن مزبور و پروتئین آن در گروه آزمون کاهش معناداری یافته است. این نتایج نشان داد که قرار گرفتن در معرض آرسنیک روی اسپرماتوژنز و پارامترهای اسپرم تاثیر میگذارد(Li, Wang, & Wang, 2012).
در سال ۲۰۰۸، Akimoto و همکارانش عملکرد ژن Kdm5d را در طی فرآیند اسپرماتوژنز مورد بررسی قرار دادند و با آنالیز ایمونوهیستوشیمی به این نتیجه رسیدند که Kdm5d عملکرد اختصاصی مردانه در دمتیله کردن H3K4 در سلولهای زایای بیضه داشته و بدین وسیله پروتئین آن در فشرده کردن کروماتین قبل از ورود به میوز نقش تنظیمی دارد(Akimoto et al., 2008).

فصل سوم
مواد و روشها

در این تحقیق تاثیر استرس اکسیداتیو بر بیان ژن Kdm5d در بیضه موشهای نر بالغ بررسی گردید و در انجام آن از مواد و روشهای مختلفی استفاده شد. این کار پژوهشی در آزمایشگاه ژنتیک پژوهشگاه رویان انجام گرفت.
فهرست دستگاهها و لوازم مورد استفاده:
۱- PCR
۲- Real-time PCR
۳- Steerer((Hot plate
۴- میکروسکوپ فلورسنت
۵- دستگاه شمارنده آزمایشگاهی
۶- ثبت تصویر ژل
۷- الکتروفورز و منبع تغذیه
۸- سانتریفیوژ یخچالدار
۹- فلوسایتومتری
۱۰- اسپکتروفتومتر و کووتهای استریل
۱۱- بن ماری
۱۲- ورتکس
۱۳- نانودراپ
۱۴- هود لامینار
۱۵- ترازوی دیجیتال
۱۶- ترمومیکسر
۱۷- راکر
۱۸- تانک ازت
۱۹- ماکروویو
۲۰- فریزر ۷۰- درجه
۲۱- انواع سمپلر
۲۲- انواع سرسمپلر فیلتردار
۲۳- ویال و استریپ
۲۴- تیغ استریل جراحی
۲۵- لام و لامل
۲۶- لوله آزمایش ۱۵ میلی لیتری

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   ویژگی های شخصیتی و ویژگی های شخصیت

فهرست مواد مورد استفاده:
۱- TRI® reagent
۲- ۲-propanol
۳- DNase I Buffer
۴- First strand cDNA synthesis kit
۵- EDTA
۶- UltraPureTM Agarose
۷- Tris (Trizma base)
۸- PBS
۹- DMEM
۱۰- ۶X DNA Loading Dye
۱۱- DNA Ladder 50 bp
۱۲- Ethidium Bromide (10mg/ml)
۱۳- dNTP Mix 10mM
۱۴- MgCl2 50mM
۱۵- SmarTaqTM DNA Polymerase
۱۶- Power SYBR Green PCR Master
۱۷- PI
۱۸- miScript Reverse Transcription Kit
۱۹- miScript SYBR Green PCR Kit
۲۰- TUNEL Kit
شیوه انجام کار
به منظور بررسی تاثیر استرس اکسیداتیو بر بیان ژن Kdm5d، ابتدا میزان درصد رادیکالهای آزاد درون بافتهای بیضه نرمال و تیمار شده توسط فلوسایتومتری سنجیده شد، سپس میزان بیان این ژن از طریق تکنیکReal time PCR مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، میزان شکست DNA هم بهروش TUNEL با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت سنجیده شد.
در ادامه به چگونگی انجام هر روش به تفصیل پرداخته میشود.
۳-۱- تعیین گروههای آزمایشی
نمونههای مورد مطالعه در این تحقیق شامل نمونههای کنترل (تزریق شده با آب) و نمونه های تیمار (تزریق شده با t-BHP) بودند. مقدارکل نمونه در این تحقیق ۱۰ مورد و تعداد نمونه درهر گروه ۵ مورد بود.
۳-۲- جمع آوری نمونهها و محل انجام آزمایش
ابتدا موشهای نر بالغ (۸-۱۰ هفتهای) با نژاد Balb/C از انستیتو پاستور دریافت شد. علت انتخاب این گونه، وجود شباهتهای ژنتیکی، فیزیولوژیکی و تولیدمثلی میان موش و انسان، سادگی، سرعت تکثیر و سهولت در نگهداری و پرورش آنها بود. سپس در حیوانخانه پژوهشگاه رویان، با شرایط دمایی C° ۲۵-۲۰ و دوره ۱۲ ساعت روشنایی و ۱۲ ساعت تاریکی و نیز دسترسی آسان به آب و غذا نگهداری شدند. جهت حذف استرس ناشی از حمل و نقل و تطبیق حیوانات با محیط جدید، یک هفته قبل از شروع آزمایش، موش‌ها به محل نگهداری منتقل شدند.

۳-۳- القاء استرس اکسیداتیو با تزریق t-BHP
Kaur و همکاران نشان دادند که تزریق یک‌دهم برابرِ میزانِ دوز کشنده ۵۰‌درصد (LD50)، از ماده t-BHP به مدت ۱۴ روز به موش‌ها، می‌تواند سبب القاء استرس اکسیداتیو شود(Shapiro, 2005).
فاطمی و همکاران، LD50 برای t-BHP را با مقادیر ۴۰۰، ۵۰۰ و ۶۰۰ میکرومول به ازاء هر ۱۰۰ گرم وزن بدن تعیین کردند. ابتدا موشها وزن شدند و از همان ابتدا به دو گروه کنترل و تیماری تقسیم شدند، سپس طی یک دوره چهارده روزه (بین ساعت ۱۰-۱۲) به صورت داخل صفاقی تزریق صورت گرفت. به منظور شبیه سازی اثر استرس احتمالی ناشی از تزریق، به گروه کنترل آب مقطر تزریقی به مدت ۱۴ روز تزریق گردید. در مدت زمان تزریق، وزن موشها ۴ مرتبه اندازهگیری شد. پس از گذشت ۱۴ روز، موشها به روش جابجایی مهره های گردن۳۷ کشته شدند و وزن بافت بیضه در هر دو گروه کنترل و آزمون، گزارش گردید.
۳-۴- تک سلول کردن بافت بیضه
ابتدا محلول آنزیمی شامل دیسپاز۳۸ (۱ میلیگرم در میلیلیتر)، کلاژناز۳۹ (۱ میلی گرم در میلیلیتر) و هیالورونیداز۴۰ (۱ میلیگرم در میلیلیتر) به ازای هر بافت، ۴ میلیلیتر تهیه شد. پس از کشتن حیوان، بافت بیضه جدا شده و در پلیت حاوی PBS قرار گرفت. با کمک دو پنس، کپسول بیضه پاره شد و محتویات آن به پلیت حاوی DMEM انتقال یافت. پس از خرد کردن بافت، مخلوط حاصله ۱ دقیقه با دور ۱۰۰۰ rpm سانتریفوژ شد. مایع رویی خارج و به رسوب ۲ میلیلیتر محلول آنزیمی اضافه شد و به مدت ۱۰ دقیقه پیپت شد تا لولهها باز شوند (پلیت در تمام مدت روی صفحه گرم۴۱ قرار داشت). پس از آن محیط و بافت، مجددا̋ با همان شرایط قبل سانتریفوژ شدند. این بار نیز مایع رویی خارج، مجدد ۲ میلیلیتر آنزیم اضافه شد و ۱۵ دقیقه پیپت شد. سپس ۲ میکرولیتر IDNase (غلظت نهایی۱میکرولیتر در هر میلیلیتر) اضافه شد و در انکوباتور قرار گرفت. به دنبال اطمینان از باز شدن لولهها زیر میکروسکوپ، آنزیم با DMEM حاوی ۱۵% FBS خنثی شد. در نهایت سوسپانسیون از فیلتر ۴۰ میکرومتری عبور داده شد.
۳-۵- شمارش تعداد سلولهای زنده در بافت بیضه
پس از تک سلول کردن بافت بیضه، ۷ میکرولیتر تریپانبلو (۴/۰%) با ۷ میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی مخلوط شد و روی لام نئوبار قرار گرفت و با میکروسکوپ معکوس۴۲ شمارش سلولها انجام شد. این لام به صورت یک صفحه شطرنجی شکل با چهار خانه بزرگ در گوشههایش است (شکل ۳-۱). سلولهای فاقد رنگ درون این چهارخانه را شمرده و مجموع آنها بر چهار تقسیم میشود تا میانگین بدست آید. آنها در مقدار میلیلیتر موجود در محیط کشت ضرب میشوند که ۵ میلیلیتر است و سپس ضربدر ضریب رقت که ۲ است و در آخر در ده به توان چهار (که یک عدد نرمالایز شده است) ضرب میشوند و عدد حاصل،

دیدگاهتان را بنویسید