هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌ها را تغییر بدهد. در این تست سلول‌های بیوفیلم شسته می‌شوند تا دلایل تغییرات هیدروفوبیسیتی مشخص شوند که متعاقباً توضیح داده می‌شود(10، 80).
2-7-1- روش MATH برای سلول‌های موجود در بیوفیلم
برای انجام این آزمایش باید ابتدا بیوفیلم باکتری‌های جداسازی شده، تشکیل شود که این مورد توسط تست لوله‌ای63 صورت گرفت.
2-7- 1-1- روش تست لوله‌ای برای سلول‌های موجود در بیوفیلم
مواد و وسایل لازم:
لوله‌های شیشه‌ای با اندازه‌ی nm 100*13
محیط TSB
پیپت
بافر PBS
روش انجام آزمایش:
در این تست، لوله‌های شیشه‌ای حاوی 3 میلی‌لیتر محیط تریپتیکاز سوی براث با یک لوپ پر از کلنی باکتری های جداسازی شده ، تلقیح می‌شوند.
سپس این لوله‌ها در دمای ?C30 به مدت 24 ساعت روی شیکر با دور rpm 100 قرار می‌گیرند. بعد از گذشت این زمان، محتویات لوله‌ها به آرامی توسط یک پیپت خارج شده و هر لوله یک بار با فسفات بافر سالین شسته می‌شود. به این صورت که 3 میلی‌لیتر بافر به لوله اضافه کرده و دو بار با پیپت خارج می‌شود. سپس دوباره 3 میلی‌لیتر بافر به لوله‌ها اضافه شده و لوله به مدت 2 دقیقه ورتکس می‌شود. عمل ورتکس کردن سبب می‌شود که بیوفیلم متصل به دیواره‌ی لوله‌ها تخریب و سلول‌ها در بافر فسفات سالین آزاد شوند.
2-7-1-2- روش انجام آزمایش MATH برای سلول‌های موجود در بیوفیلم
سوسپانسیون به دست آمده از تست لوله‌ای حاوی سلول‌های بیوفیلم می‌باشد. برای شستشوی این سلول‌ها سانتریفوژ این سوسپانسیون در دور rpm 3000 و به مدت 15 دقیقه صورت می‌گیرد. سپس محلول رویی دور ریخته شده و رسوب سلول‌ها در ته لوله دوباره در بافر حل می‌شود. این عمل 3 مرتبه تکرار می‌شود تا سلول‌ها به خوبی شسته شوند و پلی‌ساکارید خارج سلولی تا حد امکان حذف شود. پس بعد از آخرین مرحله‌ی شستشو، یک سوسپانسیون معادل استاندارد نیم مک‌فارلند از سلول‌های رسوب یافته تهیه می‌شود و در نهایت همانند آزمایش‌های قبلی، تست MATH برای تعیین هیدروفوبیسیتی سطح سلول ها انجام می‌شود.
2- 8- روش‌های به کار رفته در ارزیابی قدرت اتصال هر یک از باکتری‌ها به سطوح و بررسی ساختار بیوفیلم
2-8-1- روش تشکیل بیوفیلم روی اسلایدهای شیشه‌ای به منظور ردیابی64 تشکیل بیوفیلم
در این آزمایش، اتصال باکتری‌ها به لام شیشه‌ای که در مخلوط باکتری‌ها قرار گرفته است مورد بررسی قرار می‌گیرد. البته باید ذکر شود که شیشه دارای خاصیت هیدروفوبی کمتری نسبت به هیدروکربن می باشد و باید نتایج حاصل از این آزمایش با آزمایش MATH مقایسه شوند. هدف این آزمایش مشخص کردن این که کدام یک از باکتری‌ها زودتر به سطح لام متصل می‌شوند و در تشکیل بیوفیلم جزء اولین‌ها هستند، می‌باشد. همچنین با استفاده از این روش و روش بعدی که توضیح داده می شود می‌توان باکتری‌هایی را که هیچ نقشی در تشکیل بیوفیلم ندارند را نیز شناسایی کرد(10).
مواد و وسایل لازم:
محیط کشت TSA و TSB
ارلن دهانه گشاد ml 100
اسلایدهای شیشه‌ای
اتانل 96%
رنگ کریستال ویوله
روش کار:
ابتدا باکتری‌های جدا شده از بیوفیلم را فعال کرده، به این صورت که یک لوپ از کلنی باکتری مورد نظر بر روی محیط کشت جامد را به یک لوله‌ی حاوی 3 میلی‌لیتر محیط تریپتیکاز سوی براث استریل تلقیح کرده و سپس به مدت 18 تا 20 ساعت این محیط را در دمای ?C30 انکوبه می‌کنیم. بعد از گذشت این زمان، یک میلی‌لیتر از این محیط را در شرایط استریل برداشته و به کدورت معادل 5/0 مک‌فارلند می‌رسانیم(با اضافه کردن به محیط استریل در یک لوله‌ی دیگر). سپس به یک ارلن(ml 100) 50 میلی‌لیتر محیط TSB اضافه کرده و دو اسلاید شیشه‌ای که با اتانل 96% تمیز و ضد عفونی شده‌اند درون ارلن قرار داده می‌شود و بعد از پنبه‌گذاری درب ارلن، اتوکلاو آن صورت می‌گیرد. بعد از اتوکلاو و سرد شدن ارلن‌ها‌، نوبت به تلقیح آنها توسط سوسپانسیون میکروبی می‌رسد. برای این منظور 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون میکروبی معادل استاندارد 5/0 مک‌فارلند در شرایط استریل به ارلن‌ها اضافه شد. سپس ارلن‌ها در دمای آزمایشگاه و روی شیکر با دور rpm 100 قرار داده شدند. در نهایت، بعد از گذشت مدت زمان‌های 4، 8، 16 و 20 ساعت اسلاید‌های شیشه‌ای از یک ارلن خارج شدند و یک اسلاید برای رنگ‌آمیزی با کریستال ویوله و اسلاید دیگر برای شمارش و شناسایی باکتری‌های مورد نظر متصل به اسلاید به کار رفت.
2-8-1-1- روش رنگ‌آمیزی اسلایدهای شیشه‌ای
بعد از این که اسلاید شیشه‌ای از ارلن خارج شد به خوبی با آب مقطر استریل به منظور حذف سلول‌های پلانکتونیک از سطح اسلاید و یا سلول‌هایی که اتصالات ضعیفی با اسلاید دارند شسته شد. سپس رنگ‌آمیزی اسلاید توسط کریستال ویوله‌ی 2% به مدت 5 دقیقه صورت گرفت و بعد از گذشت این زمان اسلایدها شسته شدند و بعد از خشک شدن در دمای آزمایشگاه، با میکروسکوپ نوری مشاهده شدند.
به منظور ردیابی باکتری‌ها در تشکیل بیوفیلم، با کمک میکروسکوپ نوری بعد از گذشت مدت زمان‌های متفاوت، اسلایدها باید رنگ‌آمیزی شوند زیرا باکتری‌های متصل به سطح اسلاید توسط رنگ کریستال ویوله رنگ شده و می‌توان در زیر میکروسکوپ نوری آنها را مشاهده کرد.
2-8-1-2- روش شمارش و شناسایی باکتری‌های متصل به سطح اسلاید
برای مشخص شدن این که کدام باکتری زودتر به سطح متصل می‌شود و نسبت به بقیه‌ی باکتری‌های موجود در سوسپانسیون میکروبی توانایی بالاتری در تشکیل بیوفیلم دارد و همچنین تعیین تراکم و تعداد سلول‌ها در بیوفیلم و تغییرات آن با گذشت زمان نیاز به شناسایی و شمارش باکتری‌های سطح اسلاید می‌باشد.
مراحل انجام آزمایش:
برای این کار، بعد از بیرون آوردن اسلاید شیشه‌ای از درون ارلن، به خوبی با آب مقطر استریل شسته شده و سپس توسط یک سواپ استریل، سطح مشخصی از آن که دارای بیوفیلم می‌باشد را برداشته و سپس سواپ را در 9 میلی‌لیتر آب مقطر استریل به شدت تکان داده تا باکتری‌های متصل شده به سر سواپ در آب مقطر رها شوند. سپس لوله‌ی مورد نظر را به مدت 1 دقیقه به منظور پراکندگی یکسان باکتری‌ها در آب مقطر، ورتکس کرده و در نهایت برای آزمایش شمارش و شناسایی به کار می‌رود. این آزمایش توسط روش drop plate صورت گرفت(40).
روش (Miles and Misra) drop plate برای شمارش و شناسایی باکتری‌های بیوفیلم:
این روش می‌تواند برای تعیین تعداد سلول‌های باکتریایی موجود در یک سوسپانسیون به کار رود.
روش Drop plate(DP) فواید زیادی نسبت به روش Spread plate(SP) دارد؛ به این صورت که روش DP زمان کمتری برای پخش قطرات سوسپانسیون روی پلیت آگار نسبت به روش SP نیاز دارد. همچنین به دلیل استفاده از قطره، این روش، بسیار سریع‌تر و همچنین با دقت بیشتری صورت می‌گیرد. از نظر آزمایشگاهی زیاد وقت‌گیر نیست و نیاز به مواد و وسایل کمتری نسبت به روش SP دارد. به علاوه، این روش توسط بسیاری از محققان در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی به کار می‌رود.
مراحل انجام آزمایش:
برای این کار، یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون میکروبی تهیه شده، توسط سمپلر برداشته شده و به یک لوله که حاوی 9 میلی‌لیتر آب مقطر استریل می‌باشد، انتقال داده می‌شود. این لوله به مدت 10 ثانیه ورتکس شد و سپس یک میلی‌لیتر از آن به دومین لوله‌ی حاوی 9 میلی‌لیتر آب مقطر استریل انتقال داده شد. این فرایند به طور دقیق تا تهیه‌ی یک سریال رقت(حدوداً تا 107) انجام شد. همچنین به منظور کشت باکتری‌ها روی محیط جامد پلیت‌های حاوی آگار به چهار قسمت مساوی تقسیم شدند که هر قسمت برای یک رقت در نظر گرفته می‌شود. سپس توسط سمپلر، 10 میکرولیتر از یک سوسپانسیون(با رقت مشخص) را برداشته و در یک قسمت از چهار قسمت یک پلیت پخش(تلقیح) می‌شود. این کار پنج مرتبه برای یک رقت مشخص انجام می‌شود و لذا در یک قسمت از یک پلیت آگار که مربوط به آن رقت خاص می‌باشد دقیقاً پنج قطره‌ی 10 میکرولیتری دیده می‌شود. این عمل را برای تمام رقت‌ها انجام داده و در نهایت بعد از جذب قطرات روی پلیت، پلیت‌های مورد نظر به مدت 24 ساعت در دمای ?C30 انکوبه می‌شوند و سپس شمارش کلونی‌ها صورت می‌گیرد. به منظور شمارش کلونی، بعد از 24 ساعت با بررسی پلیت‌ها و قسمت‌های مربوط به رقت‌ها، آن رقتی که تعداد کلونی در آن در هر قطره بین 3 تا 30 کلونی باشد انتخاب کرده و تمام کلنی‌ها در قطره شمارش می‌شود و با هم جمع شده و تقسیم بر پنج می‌گردد و با توجه به فرمول زیر تعداد کلنی مورد نظر به دست می‌آید:
{(cm2 سطح مورد نظر)(رقت مورد نظر)(حجم قطره/میانگین CFU)} Log= (CFU/cm2)Log
CFU = colony forming unit
نکته: تعداد کلنی که بین 3 تا 30 کلنی در هر قطره می‌باشند از نظر آماری قابل قبول هستند. در حقیقت، می‌توان گفت که رقت قابل شمارش، رقتی است که تعداد کلنی در هر 10 میکرولیتر از آن بین 3 تا 30 کلنی می‌باشد. شکل(2-7) به طور خلاصه این روش را نشان می‌دهد.
همچنین با توجه به خصوصیات ظاهری و متفاوت کلنی باکتری های جداسازی شده در این تحقیق و با توجه به تکنیک DP می توان در رقت قابل قبول از نظر شمارش، جمعیت غالب باکتری های موجود در بیوفیلم و در رقت های کمتر از رقت قابل شمارش، تنها باکتری هایی که در بیوفیلم وجود دارند را مشاهده کرد.همچنین در رقت بیشتر از رقت قابل شمارش، باکتری های غالب در بیوفیلم دیده می شوند.
شکل 2-7- روش DP و نحوه انجام آن
2-8-2- تعیین کمی تشکیل بیوفیلم و مقایسه‌ی بین قدرت باکتری‌های ایزوله شده برای تشکیل بیوفیلم
2-8-2-1- روش میکروتیتر پلیت برای تعیین کمیت تشکیل بیوفیلم توسط باکتری‌ها
این متد یک روش رنگ‌سنجی65 است که در حال حاضر در بیشتر آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی برای تعیین قدرت تشکیل بیوفیلم باکتری‌های متفاوت و همچنین اثر عوامل ضد میکروبی متفاوت و متنوع بر روی بیوفیلم مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش نیاز به محیط کشت بسیار کمی دارد، وقت‌گیر نمی‌باشد و می‌توان از آن برای سنجش قدرت ضد میکروبی طیف وسیعی از عوامل ضد میکروبی با غلظت‌های مختلف و همچنین در ترکیب با هم مورد استفاده قرار گیرد. اساس این روش بر پایه‌ی رنگ‌سنجی و جذب نوری می‌باشد(81).
مراحل انجام آزمایش:
برای سنجش قدرت تشکیل بیوفیلم توسط باکتری‌های جدا شده، یک کشت 18 تا 24 ساعته از هر ایزوله در تریپتیکاز سوی براث در دمای ?C30 تهیه شد. سپس یک میلی‌لیتر از این محیط کشت به 10 میلی‌لیتر از محیط TSB استریل اضافه شد و کدورت آن از طریق قرائت جذب نوری سوسپانسیون بین 08/0 تا 1/0 در طول موج nm 625 تنظیم گردید. این عمل توسط دستگاه اسپکتروفتومتر صورت گرفت. کدورت این سوسپانسیون معادل استاندارد 5/0 مک‌فارلند می‌باشد و حاوی بیش از 108 باکتری در هر میلی‌لیتر است. سپس از این سوسپانسیون، 250 میکرولیتر به هر چاهک در میکروپلیت انتقال داده شد. هر هشت چاهک در میکروپلیت با یک سوسپانسیون باکتریایی مشخص پر شدند که در این صورت در هر چاهک نزدیک به cfu/well 106*25 ‌باکتری موجود می‌باشد. چاهک‌های شاهد66 تنها حاوی محیط استریل می‌باشند. جنس میکروپلیت‌های 96 چاهکی، پلی‌استیرن67 می‌باشد و ظرفیت هر چاهک 300 میکرولیتر است. سپس سطح پلیت‌ها پوشیده شد و انکوباسیون به مدت 24 ساعت در دمای ?C30 صورت گرفت. بعد از گذشت 24 ساعت، محلول مواد غذایی و سوسپانسیون میکروبی از چاهک‌ها خارج شد و هر چاهک سه مرتبه توسط 300 میکرولیتر سرم فیزیولوژی استریل شسته شد. همچنین پلیت‌ها به منظور حذف سلول‌های پلانکتونیک یا غیر متصل در حین شستن به شدت تکان