منابع مقاله با موضوع بیوفیلم، سلول‌های، سیستم

ک کننده را می‌توان مشاهده کرد. برای نمونه‌برداری از دو روش استفاده شد.
2-3-1-1- روش نمونه‌برداری از آب سیستم و لایه‌های بیوفیلم موجود در دیواره‌ی برج‌های خنک کننده
در یک سیستم خنک کننده به دلیل فراهم بودن شرایط لازم برای رشد، باکتری‌ها هم به صورت پلانکتونیک(شناور) در آب سیستم و هم به صورت لایه‌های نازک چسبیده به دیواره‌ی برج‌های خنک کننده و سایر نقاط(بیوفیلم) دیده می‌شوند.
مواد و وسایل لازم:
ظروف نمونه‌برداری و قاشقک استریل برای برداشتن بیوفیلم
روش کار:
در این نوع نمونه‌برداری، از قسمت‌های مختلف یک سیستم خنک کننده که در شکل(1-2 و 2-2 ) نشان داده شده است نمونه‌های آب و همچنین تا حد امکان نمونه‌های بیوفیلم برداشته شد و به داخل ظروف نمونه‌برداری انتقال داده شد(89).
شکل 2- 1- نمایی از سیستم مبدل‌ها
شکل 2-2- نمایی از سیستم جت‌ها
محل‌های نمونه‌برداری:
1) نمونه‌برداری از آب قبل از رسیدن به برج خنک کننده
2) نمونه‌برداری از آب تانک هوادهی که مواد ضد باکتری و ضد خوردگی به آن اضافه شده است
3) نمونه‌برداری بعد از چرخش آب در سیستم
4) نمونه‌برداری از آب موجود در برج خنک کننده
2-3-1- 2- نمونه‌برداری از طریق گذاشتن کوپن‌های فلزی در معرض جریان آب سیستم خنک کننده
مواد و وسایل لازم:
کوپن فلزی و نگهدارنده‌ی کوپن
روش کار:
همان طور که گفته شد باکتری‌های موجود درسیستم آب خنک کننده، تمایل به اتصال به سطوح فلزی را دارند. در این روش، کوپن نیز سطح لازم را برای اتصال باکتری‌های پلانکتونیک و در نتیجه تشکیل بیوفیلم را فراهم می‌سازد. این کوپن‌ها بعد از گذشت زمان خاصی از سیستم برداشته می‌شوند و بیوفیلم تشکیل شده در سطح آنها مورد مطالعه و بررسی قرار می‌گیرد.
در این نمونه‌برداری، کوپن‌های فلزی در ابتدای یک نگهدارنده قرار گرفتند و سپس این نگهدارنده در مسیر جریان آب سیستم خنک کننده قرار گرفت. بعد از گذشت مدت 40 روز، این کوپن‌ها از مسیر جریان خارج و به داخل یک ارلن استریل حاوی آب سیستم انتقال داده شدند و سپس فوراً به آزمایشگاه برای بررسی‌های بعدی آورده شدند(89).
4-2- روش‌های به کار رفته برای جداسازی و شناسایی باکتری‌های تشکیل دهنده‌ی بیوفیلم روی سطح کوپن و یا باکتری‌های موجود در آب نمونه‌برداری شده
2-4- 1- روش به کار رفته برای کشت و جداسازی باکتری‌ها
برای این منظور از روش تهیه‌ی سریال رقت استفاده شد. همان طور که گفته شد دو نوع نمونه‌برداری در این تحقیقات صورت گرفت که نوع اول توسط کوپن‌های فلزی و نوع دوم توسط نمونه‌برداری مستقیم از آب سیستم خنک کننده و جداره‌ برج‌های خنک کننده می‌باشد.
2-4-1-1- روش جداسازی و کشت باکتری‌ها از نمونه‌ی کوپن
بعد از خارج کردن کوپن‌ها از داخل ارلن، شستشوی آنها با آب مقطر استریل صورت گرفت. شتتشو به منظور حذف سلول‌هایی است که اتصالات ضعیف با سطح بیوفیلم و کوپن دارند. سپس بیوفیلم سطح کوپن‌ها به وسیله‌ی یک اسپاتول استریل تحت شرایط استریل کنده شدند و در 10 میلی‌لیتر فسفات بافر سالین57 انداخته شد. سپس این سوسپانسیون ورتکس شد. عمل ورتکس کردن سبب پراکندگی میکروارگانیسم‌ها از درون بیوفیلم به داخل محیط مایع می‌شود و در نتیجه یک سوسپانسیون میکروبی یکنواخت ایجاد می‌شود. سپس از این سوسپانسیون، یک سریال رقت تهیه شد و روی محیط کشت نوترینت آگار58 کشت صورت گرفت. این محیط به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای ?C30 انکوبه شد. بعد از گذشت این زمان، محیط‌های کشت مورد بررسی قرار گرفتند و کلنی‌های متفاوت که از نظر ظاهر، اندازه و سایر خصوصیات دیگر با هم تفاوت داشتند با یک لوپ استریل جداسازی شده و روی یک محیط دیگر کشت و جداسازی آن ها صورت گرفت(89).
2-4-1-2- روش جداسازی و کشت باکتری‌ها از نمونه‌ی آب سیستم
در این روش ابتدا یک میلی‌لیتر از آب نمونه‌برداری شده به 9 میلی‌لیتر از فسفات بافر سالین استریل انتقال داده شد. سپس یک سریال رقت از این سوسپانسیون تهیه و کشت روی نوترینت آگار صورت گرفت. سپس به مدت 24 تا 48 ساعت انکوباسیون در دمای ?C30 صورت گرفت و در نهایت جداسازی باکتری‌ها و خالص‌سازی آنها انجام شد.
همچنین برای نمونه‌های حاصل از دیواره‌ی برج‌های خنک کننده، ابتدا مقداری از نمونه‌ی جامد در 9 میلی‌لیتر PBS استریل به صورت سوسپانسیون تهیه شد. سپس مراحل بالا برای کشت، جداسازی و خالص سازی باکتری‌ها صورت گرفت.
2-4-2- شناسایی باکتری‌های جداسازی شده
2-4-2-1- روش به کار رفته برای شناسایی باکتری‌ها
شناسایی باکتری‌های ایزوله شده با توجه به رفرنس‌های مرتبط با شناسایی باکتری‌ها صورت گرفت.
2-4-2-2- باکتری‌ استاندارد
از گونه‌ی سودوموناس آئروژینوزا سویه‌ی Pseudomonas aeruginosa PTCC1074 نیز به عنوان سویه‌ی استاندارد در آزمایشات تعیین هیدروفوبیسیتی استفاده شد.
2-4-2-3- نمودار های شناسایی باکتری‌ها( 48)
2-5- روش‌های به کار رفته برای سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌های پلانکتونیک
2-5-1- روش به کار رفته برای تعیین هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌های پلانکتونیک
همان طور که در مقدمه ذکر شد، میکروارگانیسم‌ها تمایل بالایی برای اتصال به سطوح زنده و غیر زنده دارند. این اتصال اولیه در حقیقت، همان مرحله‌ی شروع تشکیل بیوفیلم و در نهایت وارد شدن خسارات به سیستم‌های صنعتی می‌باشد. از عوامل دخیل در اتصال باکتری‌ها می‌توان به حرکت براونی یا تصادفی، حرکت ذاتی میکروارگانیسم‌ها و خاصیت هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌ها اشاره کرد. از این رو، بررسی این خاصیت در سطح سلول‌های باکتریایی بسیار مهم و باارزش می‌باشد. در این تحقیق از آزمایش اتصال باکتری‌ها به هیدروکربن اکتان به عنوان یک سطح مورد اتصال59 یا MATH برای سنجش هیدروفوبیسیتی استفاده شد(73، 58).
2- 5-1-1- روش MATH برای سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌ها
مواد و و سایل لازم:
1- فسفات بافر سالین
2- استاندارد 5/0 مک‌فارلند
3- کووت
4- دستگاه اسپکتروفتومتر
5- هیدروکربن اکتان
تهیه‌ی فسفات بافر سالین:
فرمول تهیه‌ی این بافر به صورت زیر می‌باشد:
gr8
NaCl
gr 2/0
KH2PO4
gr 9/2
Na2HPO4.12H2O
gr 2/0
KCl
ml 1000
آب مقطر
4/7
pH
روش تهیه: مواد بالا را به میزان دقیق وزن کرده و در 1000 میلی‌لیتر آب مقطر استریل حل کرده، سپس pH آن در 4/7 تنظیم می‌شود و در فشار 10 پوند، به مدت 10 دقیقه اتوکلاو کرده و بعد از سرد شدن مورد استفاده قرار می‌گیرد.
روش انجام آزمایش:
برای سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌های پلانکتونیک، ابتدا یک کشت 18 تا 20 ساعته از هر ایزوله‌ی باکتریایی60 در لوله‌های حاوی محیط کشت تریپتیکاز سوی براث61 در دمای ?C30 تهیه گردید. سپس این لوله‌ها به منظور به دست آوردن سلول‌های باکتریایی توسط دستگاه سانتریفوژ با دور rpm 3000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شدند. بعد از انجام این عمل، مایع رویی دور ریخته شد و به سلول‌های ته‌نشین شده در ته لوله، بافر فسفات اضافه شد. سپس کدورت این سوسپانسیون از طریق خواندن جذب نوری آن در nm 640 بین 08/0 تا 1/0 تنظیم شد. البته می‌توان کدورت این سوسپانسیون را از طریق مقایسه با استاندارد نیم مک‌فارلند نیز تنظیم کرد. این سوسپانسیون تقریباً حاوی 108 سلول در هر میلی‌لیتر می‌باشد.
در مرحله‌ی بعد، 5/3 میلی‌لیتر ازاین سوسپانسیون به لوله‌ی کووت اضافه شد و جذب نوری آن در nm 640 خوانده شد. این جذب نوری(OD) به عنوان A1 یا جذب نوری اولیه گزارش شد. سپس 5/0 میلی‌لیتر از هیدروکربن اکتان به کووت اضافه شد و این لوله به مدت 2 دقیقه توسط دستگاه ورتکس با دور متوسط ورتکس گردید. عمل ورتکس کردن برای افزایش سطح اتصال(تماس) باکتری‌های موجود در سوسپانسیون و هیدروکربن اکتان می‌باشد. بعد از این مدت، لوله‌ی کووت به مدت 15 دقیقه در یک محل بدون حرکت قرار داده شد تا دو فاز آبی و آلی از هم جدا شوند. با گذشت زمان دو فاز آبی و آلی مجزا شده و در نهایت جذب نوری فاز آبی در طول موج nm 640 قرائت گردید. این OD به عنوان جذب نوری ثانویه یا A2 گزارش شد. در نهایت نتایج به صورت نسبت سلول‌هایی که از فاز آبی خارج شده‌اند گزارش شد. این نسبت از فرمول زیر محاسبه می‌شود(58):
100*(A1-A2)/A1}}= درصد سلول‌های متصل به هیدروکربن
nm 640=? A1= initial OD, A2= final OD,
2-6- روش‌ به کار رفته برای سنجش هم اتصالی62 بین سویهء Micrococcus با سایر باکتری‌های جدا شده از بیوفیلم
همان طور که گفته شد به دلیل تمایل بالای میکروارگانیسم‌ها در اتصال به سطوح، باکتری‌ها اکثراً در سیستم‌های آبی به صورت متصل به سطوح دیده می‌شوند. بعد از این اتصال، باکتری‌های دیگر می‌توانند از طریق اتصال به این سویه های اولیه متصل شده به سطح، روی سطح مورد نظر تجمع پیدا کنند و از این طریق تعداد سلول‌ها افزایش پیدا کرده و منجر به تشکیل بیوفیلم می شود.
انتخاب باکتری Micrococcus loteus به عنوان سویه‌ی اصلی به دلیل فراوان بودن این باکتری در سیستم‌های آبی و بالا بودن هیدروفوبیسیتی سطح آن در اتصال به سطوح می‌باشد، زیرا این باکتری با توجه به تست MATH می‌تواند جزء اولین باکتری‌های متصل شونده به سطح باشد. حال برای سنجش هم اتصالی بین این سویه با سویه‌های دیگر، از آزمایش هم اتصالی MATH استفاده می‌شود(10).
2-6-1- روش آزمایش co-adhesion MATH برای تعیین هم اتصالی
مواد و وسایل لازم:
مواد و سایل لازم برای انجام این آزمایش همانند آزمایش MATH می‌باشد.
روش انجام آزمایش:
در این روش به میکروارگانیسم‌های یک سویه اجازه داده می‌شود که به قطرات هیدروکربن متصل شوند. سپس این قطرات هیدروکربن برای آزمایش MATH با سویه‌ی دیگر مورد استفاده قرار می‌گیرند. روش انجام به این صورت است که بعد از تهیه‌ی کشت 24 ساعته از باکتری Micrococcus loteus و سایر باکتری‌ها، این محیط‌ها برای تهیه‌ی سوسپانسیون سلولی در فسفات بافر سالین سانتریفوژ شدند. سپس از سوسپانسیون باکتری میکروکوکوس لوتئوس 5/3 میلی‌لیتر به یک لوله‌ی کووت اضافه شد و بعد 5/0 میلی‌لیتر هیدروکربن به لوله اضافه شد. بعد این لوله به مدت 2 دقیقه در دور متوسط ورتکس گردید و در نهایت در یک محل برای جدا شدن دو فاز آبی و آلی، لوله به صورت ساکن قرار گرفت. بعد از جدا شدن این دو فاز با یک سمپلر که روی 500 میکرولیتر تنظیم شده است قطرات هیدروکربن در فاز آلی که سلول‌های باکتری Micrococcus loteus به آنها متصل شده است، برداشته شدند و برای آزمایش MATH دوم با سویه‌ی دیگر به کار رفتند. این مراحل برای تمام باکتری‌های ایزوله شده انجام شد و در نهایت درصد سلول‌های خارج شده از فاز آبی محاسبه شد.
2-7- روش‌ به کار رفته برای سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌های موجود در بیوفیلم
برای مقایسه‌ی تغییرات ایجاد شده در سطح سلول‌های موجود در بیوفیلم با سلول‌های پلانکتونیک، آزمایش MATH نیز برای سلول‌های موجود در بیوفیلم صورت گرفت. علاوه بر این مقایسه، می‌‌توان دریافت که تغییرات هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌ها در بیوفیلم، ناشی از تغییرات فیزیولوژیکی ایجاد شده در سلول و یا نتیجه‌ی تولید پلی ساکارید در بیوفیلم می‌باشد، زیرا تولید پلی ساکارید در بیوفیلم سبب کاهش شدید هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌ها می‌شود.
به طور کلی، می‌توان گفت که تغییرات فنوتیپی اساسی در سلول‌های بیوفیلم نیز به نوبه‌ی خود می‌تواند

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *