منابع مقاله با موضوع بیوفیلم، تهیه‌ی، چاهک‌ها

داده می‌شوند. سپس باکتری‌های متصل به دیواره و کف چاهک، با 250 میکرولیتر اتانل 96% تثبیت شدند. بعد از 15 دقیقه، محتویات چاهک‌ها تخلیه شد و پلیت‌ها در یک محل در آزمایشگاه به منظور خشک شدن قرار گرفتند. بعد از خشک شدن، پلیت‌ها به مدت 5 دقیقه با 200 میکرولیتر رنگ کریستال ویوله‌ی 2% که برای رنگ‌آمیزی گِرم مورد استفاده قرار می‌گیرد، رنگ‌آمیزی شدند. بعد از گذشت این مدت زمان، رنگ‌های اضافی از طریق قرار دادن پلیت‌ها در مسیر جریان آب لوله‌ی شهری شسته شدند. این رنگ برای سنجش میزان بیوفیلم بسیار مناسب است و همچنین می‌تواند برای سنجش اثرات بیوسایدها بر روی بیوفیلم مورد استفاده قرار گیرد.
بعد از شستن رنگ‌های اضافی، پلیت‌ها در دمای آزمایشگاه قرار داده تا خشک شدند. بعد از خشک شدن پلیت‌ها، بیوفیلم‌ها به صورت حلقه‌های ارغوانی رنگی بر روی چاهک‌ها قابل مشاهده هستند.
سپس سنجش کمی تولید بیوفیلم به وسیله‌ی اضافه کردن 200 میکرولیتر اسید استیک 33% به هر چاهک صورت گرفت. سپس جذب نوری(OD) رنگ کریستال ویوله‌ی موجود در حلال رنگ‌بر در طول موج nm 492 توسط دستگاه ELISA reader خوانده شد. در نهایت، کلاس‌بندی ایزوله‌ها بر اساس OD بیوفیلم باکتری به صورت زیر صورت گرفت:
Non-adherent
OD ? ODC
Weakly-adherent
ODC OD ? 2ODC
Moderately-adherent
2ODC OD ? 4ODC
Strongly-adherent
4ODC OD
میانگین جذب نوری یک باکتری = OD
میانگین جذب نوری برای چاهک‌های شاهد = ODC
رده‌بندی نتایج به دست آمده از آزمایش میکروتیتر پلیت از طریق مقایسه‌ی میانگین OD به دست آمده از چاهک‌ها برای هر باکتری با میانگین OD به دست آمده از چاهک‌های شاهد می‌باشد.
2-8-3-بررسی ساختار بیوفیلم ها توسط میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ68
2-8-3-1- تهیه نمونه برای میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ
برای تشکیل بیوفیلم از روش اسلاید شیشه ای استفاده شد. به این صورت که بعد از فعال سازی باکتری ها، تلقیح ارلن های حاوی اسلاید های شیشه ای توسط سوسپانسیون باکتری صورت گرفت.
سپس ارلن ها در آزمایشگاه و روی شیکر با دور rpm 100 قرار داده شدند. در نهایت بعد از گذشت مدت زمان 24 ساعت، اسلاید های شیشه ای از ارلن خارج شدند و به آرامی توسط آب مقطر شسته شدند. سپس نمونه ها به مدت 7 روز در دمای آزمایشگاه به منظور خشک شدن و از دست دادن آب خود قرار داده شدند. بعد از خشک شدن نمونه ها، برای برقراری جریان الکترون در اطراف بیوفیلم، اسلاید ها با نقره آماده سازی شدند. سپس نمونه های آماده شده در محفظه خلاء دستگاه Vacuum BAL- TEC (sputter coater SCD005) قرار گرفتند و در نتیجه روی نمونه ها و سطح آن ها با فلز طلا پوشیده شد. سپس نمونه های آماده شده برای بررسی توسط Scanning Electron Microscopy( Philips-XL-30) مورد استفاده قرار گرفتند(10، 64).
2-8-3-2- مکانیسم های تصویر سازی توسط میکروسکوپ الکترونی
برای تصویر برداری از بیوفیلم ها توسط میکروسکوپ الکترونی از دو مکانیسم استفاده شد که در زیر به طور خلاصه تعریف می شوند:
2-8-3-2-1- مکانیسم SE : تصویر برداری از بیوفیلم ها توسط کاوشگر هایSE 69 اختلاف زبری سطح و کف یا به عبارتی دیگر مورفولوژی سطحی را نشان می دهد. ساختار بیوفیلم توسط این کاوشگر ها براحتی قابل بررسی و مشاهده می باشد.
2-8-3-2-2- مکانیسم BSE : تصویر برداری از بیوفیلم ها توسط کاوشگر های70 BSE اختلاف ترکیب شیمیائی بین سطح و کف را نشان می دهد. هر چند استفاده از این نوع تصویر سازی در میکروسکوپ الکترونی معمول نیست ولی بررسی ساختار بیوفیلم ها توسط این مکانیسم منجر به نتایج بسیار جالبی شده است. البته باید توجه داشت که هریک از کاوشگر ها درصدی از کار یکدیگر را نیز پشتیبانی می کنند.
2-9- روش‌ به کار رفته در ارزیابی قدرت حذف و یا ازبین بردن سلول‌های مولد بیوفیلم توسط عوامل ضد میکروبی
به دلیل این که حذف ناقص بیوفیلم سبب رشد و تکامل مجدد آن می‌شود پس هدف این آزمایش شناسایی و تعیین پتانسیل بعضی از عوامل ضد‌میکروبی می‌باشد که حذف قسمت اعظم بیوفیلم موفق می‌باشد. با توجه به جدید بودن تکنیک میکروپلیت و کارآیی بسیار بالای آن در سنجش تشکیل بیوفیلم و همچنین عدم نیاز این تکنیک به محیط کشت زیاد و عدم وقت گیر بودن آن، می توان از آن برای سنجش اثر بیوساید های متفاوت با غلظت های مختلف در تکرار بالا روی بیوفیلم استفاده کرد(79، 80، 81).
2-9-1- تهیه‌ی بیوسایدها با رقت‌های مورد نظر بر حسب ppm
2-9-1-1- تهیه‌ی رقت از بیوسایدهای مایع
برای تهیه‌ی رقت از بیوساید‌های مایع اطلاعات زیر در مورد آنها باید در دسترس باشد. که با توجه به برچسب روی ظرف محتوی بیوساید این اطلاعات براحتی قابل دسترسی هستند.
چگالی(دانسیته)= d
درصد بیوساید روی بطری= a
غلظت گرم در لیتر بیوساید درون بطری ad1=C1
A=c2= میزان غلظت مورد نیاز B g/lit=g/1000mg* A mg/lit= C2
برای مثال برای تهیه‌ی ml 50 از NaOCl 13% با غلظت ppm 10 به صورت زیر عمل می‌شود:
1098=d
13/0=a
پس می‌توان نوشت:
56/ 1= 198/1 * 13/0* 10= ad10 = C1
g/lit01/0=mg1000g/ * mg/lit10 = ppm10 = C2
سپس با توجه به فرمول زیر می‌توان حجم مورد نیاز از ماده‌ی مورد نظر را به دست آورد:
Ml 32/0=(56/1)/(50*01/0)=C2V2/C1=V1
پس 3/0 میلی‌لیتر از ماده‌ی ضدمیکروبی Naocl را برداشته و حجم آن را به 50 میلی‌لیتر ‌رسانیده که این کار باید توسط بالن ژوژه انجام بگیرد. در این صورت 50 میلی‌لیتر از NaoCl 13% با غلظت ppm10 به دست می آید.
2-9-1-2- تهیه‌ی رقت از بیوسایدهای جامد
برای تهیه‌ی رقت از بیوسایدهای جامدبه صورت زیر عمل می‌شود:
برای مثال برای تهیه‌ی 50 میلی‌لیتر از بیوساید سولفاتیازول با غلظت ppm10 به صورت زیر عمل می‌شود:
Mg/ml 01/0= (mg1000lit/)/(mg/lit10)= ppm 10=C = غلظت مورد نظر
mg 5/0 = mg/ml 10/0 * ml 50 = V*C = مقدار گرم از ماده‌ی مورد نیاز
mg 5/0 از ماده‌ی مورد نظر را وزن کرده و توسط بالن ژوژه آن را حل کرده و حجم به ml50.رسانده شد.
2-9-1-3- روش انجام آزمایش میکروتیتر پلیت برای تعیین پتانسیل حذف بیوفیلم توسط بیوسایدها
برای سنجش اثر عوامل ضدمیکروبی بر روی حذف بیوفیلم، بعد از آماده سازی کشت 18 تا 20 ساعته و فعال‌سازی باکتری‌ها، سوسپانسیون میکروبی معادل 5/0 مک‌فارلند از هر کدام از ایزوله‌ها تهیه شد. سپس این سوسپانسیون به نسبت 1 به 100 در تریپتیکاز سوی براث استریل رقیق شد و تمام چاهکها در یک پلیت 96 خانه‌ای با 250 میکرولیتر از این محیط پر شوند(cfu/well104*25).
بعد از تلقیح، سطح پلیت‌ها پوشیده شد و سپس به مدت 24 ساعت و در دمای 30 درجه‌ی سانتیگراد آنکوبه شدند. بعد از گذشت این مدت زمان، عوامل ضدمیکروبی فوراٌ بعد از خارج کردن محتویات چاهک‌ها و شستشوی آنها به کار رفتند.
تمام این عوامل ضد باکتریایی به مدت یک ساعت بکار رفتند.همچنین هر 8 چاهک در یک ستون،‌ یک تیمار مشابه دریافت کردند. به دلیل این که احتمال می‌رود که تراکم بالای سلول‌ها در بیوفیلم، عوامل ضدمیکروبی را که با این حجم‌(250 میکرولیتر) بکار رفته اند را خنثی کند. هر بیست دقیقه یک بار این عوامل عوض شدندRefresh. علاوه بر این، ستون‌های تیمار شده، ستون‌های کنترل (حاوی بیوفیلم و بدون تیمار) و همچنین ستون‌های شاهد‌(حاوی محیط براث استریل) در هر پلیت وجود داشتند.
بعد از گذشت یک ساعت، عوامل ضدمیکروبی بوسیله‌ی شستن چاهک‌ها خارج شدند و سپس چاهک‌ها با 200 میکرولیتر کریستال ویوله‌ی 2% به مدت 5 دقیقه رنگ شدند. به دلیل اینکه کریستال ویوله رنگی است که می‌تواند کل بیوفیلم71 را رنگ کند یک رنگ مناسب برای سنجش حذف بیوفیلم می‌باشد.
بعد از گذشت مدت زمان 5 دقیقه، چاهک‌ها با آب شیر شسته شدند و سپس با 200 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال 33% پر شدند. سپس پلیت‌ها به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند و بعد از این مدت به شدت تکان داده شدند و جذب نوری آنها در طول موج 492 نانومتر خوانده شد.
سپس سنجش کارایی بیوساید یا درصد کاهش بیوفیلم72 از طریق جذب نوری چاهک‌های تیمار شده، کنترل و شاهد با توجه به فرمول زیر محاسبه شد:
(C-B)? 100 /‍‍ [(C-B)-(T-B)] = percentage reduction
میانگین جذب نوری چاهک‌های کنترل = C
میانگین جذب نوری چاهک‌های شاهد = B
میانگین جذب نوری چاهک‌های تیمار شده = T
2-9-2- روش میکروتیتر پلیت برای تعیین پتانسیل کشتن سلول‌های مولد بیوفیلم توسط بیوسایدها
همانطور که گفته شد تشکیل بیوفیلم خسارت‌های زیادی را در صنایع متفاوت بر جای می‌گذارد. از این رو از بیوسایدهایی که توانایی حذف قسمت اعظم بیوفیلم را دارند بطور زیادی در صنایع مختلف استفاده می‌شود.اما باید توجه داشت که حذف ناقص بیوفیلم، قسمت مانده‌ی بیوفیلم روی سطوح که هنوز دارای تعدادی سلول‌های زنده می‌باشد توانایی رشد مجدد73 را دارد و می‌تواند بعد از گذشت مدت زمان کوتاهی به حالت اولیه‌ی خود برگردد و ساختمان خود را تعمیر کند و دوباره سبب آلودگی سیستم شود. از این رو توجه به این نکته ضروری است که بعد از اثر عوامل ضدمیکروبی چه میزان و یا چه تعداد از سلولهای بیوفیلم هنوز زنده هستند و توانایی رشد و تکثیر را دارند. در نتیجه در این آزمایش از یک رنگ تنفسی به نام 2، 3 و 5- تری فنیل تترازولیوم کلراید74 یا TTC استفاده شد. TTC محلول در آب می‌باشد و پتانسیل ردوکس آن در حدود V 08/0- می‌باشد و می‌تواند به عنوان یک پذیرنده‌ی الکترون برای هیدروژنازهای متفاوت عمل کند.نزدیک به تمام میکروارگانیسم‌ها توانایی احیاء TTC را به تری فنیل فورمازان75 یا TPF دارند که می‌تواند از طریق رنگ‌سنجی جذب آن در طول موج nm 450 خوانده شود(79).
تمام مواد و وسایل لازم برای تعیین قدرت حذف بیوفیلم، در این آزمایش نیز به کار می‌روند با این تفاوت که به جای رنگ کریستال ویوله از رنگ تری فنیل تترازولیوم کلراید 2% استفاده می‌شود.
2-9-2-1- تهیه‌ی رنگ تری فنیل تترازولیوم کلراید 2%
تهیه‌ی بافر تریس HCl mM 100(Tris-HCl 100mM):
1/12 گرم از ترکیب Tris(hydroxymethyl)-aminomethane را در 700 میلی‌لیتر آب مقطر استریل حل کرده و pH آن روی 8/7 تنظیم می‌شود. سپس حجم نهایی آن توسط آب مقطر استریل به 1000 میلی‌لیتر رسانده می‌شود.
تهیه‌ی محلول TTC:
2/0 گرم از پودر TTC که به صورت پودر می‌باشد را در 80 میلی‌لیتر از بافر تهیه شده حل کرده و سپس حجم نهایی آن را توسط همان بافر به 100 میلی‌لیتر ‌رسانیده و دقت شود که محلول TTC تهیه شده به نور حساس است و در نور زیاد غیر‌فعال می‌شود. به همین دلیل باید اطراف ظرف حاوی محلول آن فویل آلومینیوم پیچیده شود و یا یک ظرف با جداره‌ی تاریک برای نگهداری آن انتخاب شود.
2-9-2-2- روش انجام آزمایش میکروتیترپلیت برای تعیین پتانسیل کشتن سلول‌های مولد بیوفیلم و موجود در آن توسط عوامل ضد‌میکروبی
برای سنجش اثر عوامل ضدمیکروبی در کشتن سلول‌های بیوفیلم، روش آزمایش دقیقا” عین آزمایش تعیین پتانسیل حذف بیوفیلم می‌باشد اما در آخر کار به جای استفاده از رنگ کریستال ویوله، در این آزمایش از رنگ TTC با غلظت 2/0% استفاده می‌شود. همچنین مدت زمان انکوباسیون میکروپلیت‌ها با این رنگ نزدیک به 2 ساعت و در دمای30 درجه سانتیگراد و در تاریکی می‌باشد.
در نهایت بعد از شستشوی چاهک‌ها و استفاده از اسیداستیک گلاسیال 33% جذب نوری چاهک‌ها در 450 نانومتر توسط دستگاه ELIZA reader خوانده می‌شود. نحوه‌ی محاسبه‌ی درصد کاهش یا کارآیی بیوسایدها نیز همانند روش قبلی می‌باشد(79،

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *