منابع مقاله با موضوع باکتری، بیوفیلم، نتایج

9، 81).
2-10- بررسی های آماری:
اختلاف معنی دار بین داده ها در آزمایشات فوق توسط آزمون ویلکاکسون مورد بررسی قرار گرفته است.(با درجه اطمینان برابر با 05/0 و احتمال برابر با 95% )
فصل سوم
3- نتایج
در این فصل در ابتدا به بررسی نتایج حاصل از شناسایی باکتری ها پرداخته می شود.
سپس نتایج حاصل از آزمایشات مربوط به بررسی خصوصیات سطحی باکتری های پلانکتونیک، باکتری های موجود در بیوفیلم و نتایج هم اتصالی باکتری ها با باکتری میکروکوکوس آورده شده است.
یعد از این موارد، بررسی نتایج حاصل از عکس های میکروسکوپ نوری و الکترونی صورت می گیرد.
در نهایت نیز نتایج مربوط به اثر بیوساید ها بر روی بیوفیلم باکتری ها آورده شده است.
3-1- جداول شناسایی و تست های بیوشیمی سویه های ایزوله شده
3-1-1- باسیلوس ها:
باکتری های g+، هوازی و میله ای شکل هستند. این باکتری ها تولید اسپور مقاوم به حرارت می کنند که به مقدار فراوان در گرد و غبار وجود دارد. باسیل های شناسایی شده در این تحقیق، باسیلوس لیکنی فرمیس و باسیلوس پلی میگزا می باشند.
کلنی های باسیلوس لیکنی فرمیس بر روی سطح آگار برآمده و خشن هستند. این کلنی ها به سطح آگار می چسبند و در محیط گلوکز آگار یا گلوتامات گلیسرول آگار، اسلایم روی کلنی ها جمع می شود. این باکتری می تواند از سوکروز و رافینوز، لوان خارج سلولی تولید کند. باسیلوس پلی میگزا نیز در محیط NA کلنی های لعابی می دهد. این باکتری دارای کپسول بسیار بزرگ می باشد. همچنین این باکتری می تواند از سوکروز، لوان تولید کند(48).
کاتالاز
تولید اسید از
اندول
هیدرولیز ژلاتین
حرکت
احیاء نیترات یا نیتریت
VP
رشد بی‌هوازی
مصرف سیترات
EYA
تولید گاز از گلوکز
تست
باکتری
گزیلوز
گلوکز
+
+
+

+
+
+
+
+
+


B. licheniformis
+
+
+

+
+
+
+
+


+
B. polymyxa
جدول 3- 1- بعضی از تست های بیوشیمی جهت شناسایی باسیلوس ها(48)
3-1-2- میکروکوکوس لوتئوس:
باکتری g+ و کوکسی می باشد که بر اساس محیط زندگی آن و عدم توانایی در تخمیر گلوکز از استافیلوکوک ها تشخیص داده می شود. این باکتری در سیستم های آبی به فراوانی یافت می شود و با اینکه فاقد قدرت حرکت می باشد، توانایی بالایی در تشکیل بیوفیلم دارد. بعضی از خصوصیات این باکتری در جدول(3 2)آمده است.
جدول 3-2- بعضی از تست های بیوشیمی جهت شناسایی میکروکوکوس لوتئوس(48)
هیدرولیز آرژینین
تولید اسید از
احیاء نیترات
پیگمان
VP
اکسیداز
حرکت
تست
باکتری
سوکروز
فروکتوز
گلوکز





زرد

+

Micrococcus luteus
3-1-3- اسینتوباکتر ها:
باکتری های g- و کوکوباسیل یا کوکوئید هستند که در سیستم های آبی به فراوانی یافت می شوند. این باکتری ها روی NA رشد بسیار سریع دارند و کلنی های لعابی تشکیل می دهند. اکتینوباسیلوس و برانهاملا نیز در این تحقیق جداسازی شدند که خصوصیات آن ها در جدول (3-3) آمده است. البته باید ذکر شود که دو سویه آخر با توجه به تست های انجام شده به احتمال زیاد اکتینوباسیلوس و برانهاملا می باشند.
جدول 3-3- تست های بیوشیمی جهت شناسایی برانهاملا، اسینتوباکتر و اکتینوباسیلوس(48)
احیاء نیترات
تولید اسید از
رشد روی NA
پیگمان
O/F
اکسیداز
کاتالاز
رشد هوازی
واکنش گرم
تست
باکتری
سوکروز
مالتوز
لاکتوز
گلوکز
+




+


+
+
+

Branhamella catharalis
+



+
+

O+

+
+

Acinetobacter PTC2
+



+
+

O+

+
+

Acinetobacter PTC3
+

+

ND
+
+
F+
+/-
+
+

Actinobacillus
توضیح علائم: O+ : اکسیداتیو، F+ : فرمانتاتیو ، ND : تعیین نشد.
3- 2- نتایج مربوط به تعیین هیدروفوبیسیتی سطح سلول ها
3-2-1- نتایج مربوط به تعیین هیدروفوبیسیتی سطح سلول های پلانکتونیک
این نتایج در شکل(1-3 ) آورده شده است. همانطور که در نمودار مشخص است بیشترین مقدار هیدروفوبیسیتی سطح سلول ها مربوط به برانهاملا( نزدیک به 70%) و سپس میکروکوکوس لوتئوس (6/66% ) می باشد. این دو باکتری توانایی بالایی در اتصال به سطوح هیدروفوب دارند به راحتی می توانند از فاز مایع خارج شده و به قطرات هیدروکربن متصل شوند. در این آزمایش هیدروکربن اکتان نقش یک سطح هیدروفوب را بازی می کند.
همچنین کمترین مقدار مربوط به باسیلوس پلی میگزا و باکتری استاندارد یعنی سودوموناس آئروژینوزا می باشد. برخلاف دو باکتری قبلی، این باکتری ها در اتصال به قطرات هیدروکربن موفق نیستند و تمایل کمی برای اتصال دارند.
شکل 3-1- درصد سلول های باکتری متصل به هیدروکربن اکتان
3-2-2- نتایج مربوط به سنجش هم اتصالی بین سویه میکروکوکوس لوتئوس با سایر باکتری ها
در این آزمایش سطح سلول باکتری به عنوان سطح مورد اتصال توسط باکتری های دیگر در نظر گرفته می شود.
با مقایسه نتایج حاصل از این آزمایش با آزمایش قبلی مشخص می شود که هم اتصالی تنها بین سویه میکروکوکوس با سه سویهء باسیلوس لیکنی فرمیس، اسینتوباکتر PTC3 و اسینتوباکترPTC2 صورت گرفته است. می توان گفت که میکروکوکوس سبب افزایش اتصال دو باکتری اول و کاهش اتصال باکتری آخر به هیدروکربن شده است. در حقیقت دو باکتری از بین باکتری های جداسازی شده توانایی اتصال به این سطح را از خود نشان دادند. (اختلاف معنی دار داده های این آزمایش با داده های حاصل از آزمایش قبلی).
شکل 3-2- هم اتصالی بین سویه میکروکوکوس لوتئوس با سایر باکتری های ایزوله شده
3-2-3- نتایج مربوط به سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول های موجود در بیوفیلم
با توجه به بالا بودن هیدروفوبیسیتی سطح سلول های اکتینوباسیلوس و برانهاملا، این دو باکتری در تست لوله ای تشکیل بیوفیلم ندادند( عدم اتصال این باکتری ها به دیواره لوله های شیشه ای). همچنین سلول های دو سویه باسیلوس در بیوفیلم، بعد از چند بار شستشو، باز خاصیت آبدوستی یا هیدروفیلی خود را حفظ کرده بودند. در نتیجه در تست BIO-MATH هیچ تمایلی برای اتصال به هیدروکربن از خود نشان ندادند. در حقیقت خاصیت آبدوستی بالای این سلول ها در این تست سبب ایجاد یک سوسپانسیون کدر از آب و هیدروکربن اکتان می شد.همانطور که در شکل(3-3 ) دیده می شود هیچ اختلاف معنی داری بین نتایج مربوط به سودوموناس آئروژینوزا در این آزمایش با آزمایش MATH وجود ندارد. اما بین نتایج مربوط به میکروکوکوس لوتئوس، اسینتوباکتر PTC2 و اسینتوباکتر PTC3 با آزمایش MATH اختلاف معنی دار وجود دارد. به این معنی که هیدروفوبیسیتی سطح سلول ها در بیوفیلم دستخوش تغییرات خاص شده است که در قسمت بحث پایان نامه توضیح داده می شود.
شکل 3-3- سنجش هیدروفوبیسیتی سلول های موجود در بیوفیلم توسط تست BIO-MATH
3-3- نتایج حاصل از روش میکروتیتر پلیت برای تعیین کمیت تشکیل بیوفیلم و مقایسه بین قدرت باکتری های ایزوله شده برای تشکیل بیوفیلم
نتایج حاصل از این روش (شکل 3-4 و جدول 3-4 ) نشان داده شده است. مشخص شد که اکتینو باسیلوس و برانهاملا با وجود داشتن هیدروفوبیسیتی بالا توانایی تشکیل بیوفیلم را ندارند. در نتیجه در آزمایشات بعدی این دو باکتری حذف شدند. بیشترین توانایی تشکیل بیوفیلم در این دو آزمایش مربوط به بیوفیلم مخلوط، اسینتوباکتر PTC3 و اسینتوباکتر PTC2 می باشد که بعد از آن ها باسیلوس پلی میگزا ، باسیلوس لیکنی فرمیس و میکروکوکوس قرار دارند.
شکل3-4- مقایسه بین قدرت باکتری های ایزوله شده برای تشکیل بیوفیلم از طریق روش میکروتیتر پلیت
جدول 3-4- مقایسه بین قدرت باکتری های ایزوله شده برای تشکیل بیوفیلم
قدرت اتصال باکتری به سطح
نوع باکتری
Non-adherent
Actinobacillus
Non-adherent
Branhamella spp.
Moderately-adherent
Bacillus licheniformis
Moderately-adherent
Bacillus polymyxa
Weakly-adherent
Micrococcus loteus
Strongly-adherent
Acinetobacter PTC2
Strongly-adherent
Acinetobacter PTC3
Weakly-adherent
P. aeruginosa
Strongly-adherent
Mix-Biofilm
3-4- نتایج مربوط به ردیابی تشکیل بیوفیلم توسط میکروسکوپ نوری
همانطور که در شکل (3-5) دیده می شود باکتری ها به صورت پلانکتونیک و پراکنده به سطح لام چسبیده اند. این باکتری ها توانایی جداشدن از سطح را دارند و می توانند دوباره به صورت شناور در محیط در آیند. در شکل (3-6) اتصالات برگشت ناپذیر باکتری ها به سطح و به یکدیگر به راحتی قابل تشخیص می باشد. این مرحله از تشکیل بیوفیلم به دلیل پیشرفت اتصالات باکتری ها بسیار با اهمیت می باشد. در این مرحله باکتری ها تکثیر پیدا کرده و میکروکلنی ها را تشکیل می دهند. در شکل (3-7) این میکروکلنی ها بزرگ شده و همچنین تولید پلی ساکارید خارج سلولی افزایش پیدا می کند و بیوفیلم تشکیل می شود. شکل (3-8) نیز یک بیوفیلم بالغ را نشان می دهد که کل سطح لام را پوشانده است و به سختی از سطح لام کنده می شود. در تشکیل بیوفیلم اتصالات بین باکتری ها از اهمیت خاصی برخوردار است. این اتصالات در شکل (3-9) به خوبی نشان داده شده اند. در این شکل سلول های باکتری میکروکوکوس در بیوفیلم که تحت یک نیروی بیرونی مثل فشار آب قرار گرفته اند از ساختمان بیوفیلم خارج شده اند. اما هرگز جدایی آن ها از بیوفیلم صورت نگرفته است. زیرا توسط پلی ساکارید های خارج سلولی به ساختمان اصلی بیوفیلم و همچنین به دیگر سلول ها متصل شده اند.
شکل 3-5- باکتری های پلانکتونیک و پراکنده که به سطح لام چسبیده اند(بزرگنمایی 40 ).
شکل 3- 6- اتصالات برگشت ناپذیر باکتری ها به سطح و به یکدیگر(بزرگنمایی 40)
شکل 3-7- گسترش میکروکلنی ها در سطح لام شیشه ای( بزرگنمایی 40 )
شکل 3-8- یک بیوفیلم بالغ که کل سطح لام را پوشانیده است(بزرگنمایی 40).
شکل 3-9- اتصالات بین سلول ها در بیوفیلم، فلش ها سلول های خارج شده از بیوفیلم و خود بیوفیلم را نشان می دهند.(بزرگنمایی 100)
3-5- نسبت رشد سلول ها درون بیوفیلم (Biofilm growth rate) در مدت زمان 24 ساعت
همانطور که در شکل (3-10) نشان داده شده است. بیوفیلم در ساعت 24 از نمونه برداری دارای تعداد بیش از 108cfu/cm2 سلول باکتری می باشد.
شکل 3-10- میزان رشد بیوفیلم در محیط TSB و مدت زمان 24 ساعت
3-6- نتایج مربوط به مقایسه اتصال باکتری ها در بیوفیلم مخلوط به سطح اسلاید شیشه ای
در این تست باکتری های مشاهده شده در رقت بیشتر از رقت قابل شمارش(برای

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *