مقاله رایگان با موضوع گروه کنترل، سطح معنادار، آشکارسازی، نرم افزار

دانلود پایان نامه

لذا در هنگام کار با اتیدیوم بروماید رعایت اصول ایمنی ضروری است. به سبب خاصیت فلورسانس اتیدیوم این ماده و ترکیب آن با بازهای داخل مولکولهای DNA، شدت نور حاصله از اینترکاله شدن اتیدیوم بروماید، باندها قابل رویت و توسط دستگاه ثبت ژلذخیره میشوند. جهت تهیهی محلول اتیدیوم بروماید به ازای هر لیتر آب مقطر، ۵۰ میکرولیتر اتیدیوم بروماید به آن اضافه گردید.
۳-۸-۸- بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش واکنش زنجیرهای پلیمرازپیوسته۶۷
برای بررسی و مقایسهی میزان بیان ژن Kdm5d در نمونههای بافت بیضهی موشهای بالغ، از واکنش زنجیرهای پلیمراز پیوسته استفاده شد. در روش RT-PCR، بررسی بیان ژن به صورت کیفی انجام شد و حضور یا عدم حضور باندها و تا حدی شدت باندها نشان دهنده تغییرات بیان ژن بود. اما با روش Real-Time PCR، بررسی این تغییرات به صورت کمی انجام شد. در سال ۱۹۹۶ شرکت ABI تکنیک Real-time PCR را به صورت تجاری معرفی کرد و تا به امروز این روش کمی، صحیحترین و حساسترین روش برای آشکارسازی و کمیسازی اسیدهای نوکلئیک به شمار میرود. اختصاصی بودن و حساسیت بالای آن همراه با آشکارسازی مستقیم قطعات هدف، با استفاده از پرایمرها و پروبهای نشاندار شده با مواد فلورسنت و یا رنگهای فلورسنت، مشکلاتی از قبیل ژل الکتروفورز، انتقال به غشا، دورگهسازی۶۸ پروبهای رادیواکتیو و محدودیتهای فیلم به عنوان آشکارساز را برطرف ساخت.
Real-time PCR از مولکولهای گزارشگر فلورسنت برای نمایش محصولات تکثیر شده در طول هر سیکل واکنش PCR استفاده میکند. این تکنیک امکان آشکارسازی محصول PCR در طول فاز لگاریتمی واکنش و همچنین ترکیب مرحله تکثیر و آشکارسازی در یک مرحله را فراهم ساخته و نیازی به بررسی پس از PCR، مانند ژل الکتروفورز نیست. مقدار فلورسانس منتشر شده مستقیما به مقدار محصول تولید شده در هر سیکل PCR نسبت داده میشود، بنابراین میتواند به عنوان یک سنجش کمی از واکنش PCR به کار رود. محصولات PCR را میتوان با استفاده از رنگهای فلورسانس که به DNA دو رشتهای متصل میشوند، یا با استفاده از پروبهای نشاندار شده با مواد فلورسانس ویژه، مورد سنجش قرار داد.

۳-۸-۸-۱-روش Ct مقایسهای برای کمیسازی نسبی
در این روش، به جای منحنی استاندارد از یک فرمول ریاضی استفاده میشود. مقدار هدف نرمال شده نسبت به یک کنترل درونی و نسبت به یک کالیبراتور با استفاده از فرمول زیر محاسبه میشود: ۲-ΔΔCt
هنگام استفاده از این متد، میتوان با کمک دادههای حاصل در طول آزمایش PCR، یعنی مقادیر Ct، آنها را مستقیما نسبت به یک مرجع درونی نرمال کرد و دیگر نیازی به تهیه منحنی استاندارد برای ژن هدف و کنترل درونی در تمام نمونههای آزمایشی نیست. این موضوع زمانی مفید است که یک مقدار محدود از RNA در اختیار دارد یا زمانی که میخواهد پردازش گستردهای از تعداد زیادی نمونه انجام دهد.
به منظور ارزیابی کمّی بیان رونوشت Kdm5d، تکنیک Real-time -PCR با استفاده از دستگاه Applied Biosystems 7500 و پرایمر Gapdh به عنوان کنترل داخلی مورد استفاده قرار‌گرفت.مواد لازم و چرخههای دمایی به ترتیب در جدول (۳-۹) و (۳-۱۰) ذکر شده ‌است. لازم بذکر است که cDNA ساخته شده در مرحله ۲-۸-۳ مورد استفاده قرارگرفت.
روش کار:
برای انجام Real Time-PCR، از پرایمر طراحی شده برای ژن Kdm5d و از پرایمر Gapdh به عنوان Housekeeping Gene استفاده شد. از cDNAهای سنتز شده از RNA مربوط به نمونههای بافتی، به عنوان الگو در این واکنش استفاده شد. در این روش مواد یاد شده در جدول ۳-۵، به ازای هر واکنش داخل استریپهای مخصوص Real-Time PCR ریخته شد. لازم به ذکر است که پس از افزودن مادهی فلورسنت SYBR، ادامه کار در تاریکی انجام شد، زیرا این ماده در اثر برخورد با نور غیر فعال میشود و هم چنین تمام مراحل کار روی یخ انجام پذیرفت. پس از اتمام کار، استریپهای حاوی نمونه به داخل دستگاهApplie Biosystem-7000 System ،Step One Plus System منتقل و پس از تنظیم برنامه دمایی ذکر شده در جدول ۳-۱۰، Real-Time PCR آغاز شد. اعداد نمایش داده شده در پایان کار به جای باندهای روی ژل، در روش RT-PCR تغییرات بیان ژن را نشان می دهد.

جدول(۳-۹): اجزای لازم برای انجام واکنش Real-Time PCR
مقدار (μl)
نام ماده
۶
dH2O
۱
Primer Forward (5pmol/μl)
۱
Primer Reverse (5pmol/μl)
۱۰
SYBR® Premix Ex Taq II
۲
cDNA (12.5 ng/μl)
۲۵
Total volume

جدول(۳-۱۰): برنامه دمایی Real-Time PCR
عملکرد هر مرحله
دما (درجه سانتیگراد)
زمان
تکرار
Initial denaturation
۹۵
۴ دقیقه
۱ سیکل
Denaturation
۹۵
۱۰ ثانیه

۴۰ سیکل

Annealing
۶۰
۳۰ ثانیه

Extension
۷۲
۳۰ ثانیه

Final extension
۷۲
۱۰ دقیقه
۱ سیکل

۳-۸-۶- آنالیز آماری
محاسبات مربوط به این تحقیق، در نرمافزارهای EXCEL و (version 19)SPSS با روش ΔCTوΔΔCT صورت گرفت و با استفاده از آزمون t دو نمونه‌ای مستقل، ارزیابی دادهها انجام شد. نمایش داده‌ها به صورت mean±SEM ارائه شد و معنی دار بودن نتایج در سطوح (۰۰۱/۰p)،(۰۱/۰p)و (۱/۰p) مورد بررسی قرار گرفت.پس از تعیین کارایی PCR ( با گذاشتن رقت های مختلف از یک نمونه cDNA برای هر پرایمر)، نتایج توسط نرم افزار REST نیز آنالیز شد (جدول۴-۵).

فصل چهارم
نتایج

۴-۱- بررسی وزن بدن و بافت بیضه پس از ۱۴ روز تزریق
پس از محاسبه LD50(Fatemi et al., 2013)، t-BHP به مقدار یک دهم دوزLD50 به مدت ۱۴ روز به موشهای گروه آزمون تزریق شد. گروه کنترل در مدت مشابه آب مقطر دریافت کرد. پس از اتمام دوره تزریق، وزن کامل موشها و بیضه آنها سنجیده شد که نتایج آن در جدول ۴-۱ نشان داده شده است. بازه وزن بدن در موشهای گروه کنترل ۴/۲۰ – ۸/۲۱ و در موشهای گروه تیمار ۸/۲۰ – ۶/۲۱ گرم بود. میانگین وزن بیضه در گروه کنترل ±۰۸/۰ و در گروه تیمار ±۰۷/۰ گرم بود.
جدول (۴-۱): میانگین وزن بدن در طول تزریق و بافت بیضه پس از ۱۴ روز تزریق
وزن بدن در گروه کنترل (گرم)
وزن بدن در گروه آزمون (گرم)
وزن بافت بیضه در گروه کنترل (گرم)
وزن بافت بیضه در گروه آزمون (گرم)

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   پایان نامه زمینه های اقتصادی و تغییرات اجتماعی

وزن اولیه
وزن نهایی
وزن اولیه
وزن نهایی

۲۰
۲۱
۱۹
۲۰
۰۷۷۲/۰
۰۷۳۳/۰
۲۱
۲۲
۲۱
۲۰
۰۸۲۰/۰
۰۷۱۹/۰
۲۲
۲۳
۲۱
۲۱
۰۸۳۳/۰
۰۷۴۶/۰
۱۹
۲۱
۲۳
۲۱
۰۹۲۹/۰
۰۹۱۱/۰
۲۰
۲۲
۲۴
۲۲
۰۸۹۰/۰
۰۸۵۰/۰
Mean±SD
Mean±SD
Mean ± SD
Mean ± SD
Mean ± SD
Mean ± SD
۱/۱±۴/۲۰
۸۳/۰±۸/۲۱
۹۴/۱±۶/۲۱
۸۳/۰±۸/۲۰
۰۰۷/۰±۰۸/۰
۰۰۸/۰±۰۷/۰
سطح معناداری با با استفاده از آزمون t دو نمونه‌ای مستقل تعیین گردید. نتایج نشان میدهد که تفاوت معناداری میان وزن بدن و وزن بافت بیضه در گروه کنترل و آزمون وجود ندارد (نمودار۴-۱).

نمودار (۴-۱): مقایسه وزن بدن و بافت بیضه میان گروه کنترل و آزمون.

۴-۲- بررسی ماکروسکوپی بافت بیضه
پس از اتمام دوره تزریق، موشها تشریح شده و بافت بیضه از نظر ظاهری مورد بررسی قرار گرفت (شکل ۴-۱). نتایج حاکی از آن است که در گروه آزمون خونرسانی به اندامهای تحتانی افزایش یافته است.

شکل (۴-۱): نمونههای بافت بیضه در موشهای کنترل (A) و آزمون (B).
۴-۳- بررسی میزان ROSدر بیضهی گروه کنترل و آزمون
۴-۳-۱- اندازه گیری میزان O2 و H2O2
پس از چهارده روز تزریق، بلافاصله میزان سوپراکسید و پراکسیدهیدروژن موجود در هموژنات بیضهی موش‌های گروه کنترل و آزمون، توسط فلوسایتومتر اندازه‌گیری شد. پس از بررسی نمونه‌ها توسط فلوسایتومتر، میانگین فلوئورسنت DCFH-DA و DHE در هر نمونه با کمک نرم‌افزار Cell Quest محاسبه شد (نمودار۴-۲). میانگین فلوئورسنت این دو رنگ نشان‌دهنده میزان ROS موجود در هر نمونه است. مقادیر به دست آمده برای میزان H2O2و O2 در جدول (۴-۲) نشان داده شده است. میزان H2O2 و O2 در بیضه گروه آزمون نسبت به گروه کنترل افزایش معناداری را نشان دادند. با استفاده از آزمون t دو نمونه‌ای مستقل سطح معناداری نتایج بین دو گروه کنترل و آزمون تعیین شد. سطح معناداری P ≤ ۰.۰۰۱ مؤید القاء ROS در گروه آزمون است (نمودار۴-۳)

نمودار (۴-۲): نمودار هیستوگرام از سلولهای بیضهای در یکی از نمونههای گروه کنترل و آزمون. رنگ آبی نشان دهندهی محدوده سلولهای رنگ شده با DCFH-DA و DHE را نشان می دهد. پیش‌روی نمودار هیستوگرام در طول رنگ آبی بیانگر این است که میانگین فلوئورسنت در نمونه آزمون نسبت به نمونه کنترل بیشتر است. میانگین فلوئورسنت نشان دهنده میزان ROS موجود در هر نمونه است.

جدول (۴-۲): میزان درصد H2O2 و O2 موجود در دو گروه کنترل و آزمون در نمونههای بیضهای با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری. سطح معناداری با استفاده از آزمونt دو نمونه‌ای مستقل تعیین شده است.
شماره نمونه
میزان H2O2 در نمونه‌های بیضهای کنترل
میزان H2O2 در نمونه‌های بیضهای آزمون
میزان O2 در نمونه‌های بیضه ای کنترل
میزان O2در نمونه‌های بیضه ای آزمون

سطح معناداری
۱
۷۶/۴۷
۶۶/۷۰
۳۹/۷۹
۴۵/۹۹

۲
۸۱/۵۶
۲۶/۷۸
۵۰/۳۸
۸۱/۹۹

۳
۹۷/۵۷
۰۷/۹۰
۴۸/۲۰
۶۹/۹۹

۴
۳۴/۴۲
۴۷/۸۷
۶۰/۵۰
۰۹/۹۹

۵
۹۴/۵۷
۸۳/۸۵
۵۸/۲۴
۸۹/۹۸

Mean ± SD
۱۳/۷±۵۶/۵۲
۹/۷±۴۴/۸۲
۲/۱۲±۷۹/۳۴
۳/۰±۳۸/۹۹

۰۰۱/۰ p ≤
***

نمودار (۴-۳): نتیجه حاصل از بررسی میزان ROS (H2O2 و ̊O2) در نمونههای بیضه بین دو گروه کنترل و آزمون. مقایسه بین میانگین فلوئورسنت بین دو گروه کنترل و آزمون، افزایش معناداری را در میزان ROS در گروه آزمون نشان می‌دهد. *** نشان دهنده اختلاف در سطح (۰۰۱/۰p) است. داده‌های به دست آمده با استفاده از آزمونt دو نمونه‌ای مستقل بررسی شده‌اند.
۴-۴- نتایج ارزیابی شکست DNA اسپرم با تست TUNEL
پس از مشاهده نمونه زیر میکروسکوپ فلورسنت با بزرگنمایی ۱۰۰۰× در هر لام درصد اسپرمهای رنگ سبز درخشان (TUNEL مثبت) با دستگاه Cell Counter شمارش شد و محاسبه گردید. نتایج بدست آمده از گروه کنترل و آزمون در روش TUNEL با استفاده از درصدگیری در جدول(۴-۳) نشان داده شده است. در هر نمونه ۱۰۰ اسپرم شمارش میشود و درصد اسپرمهای با شکست DNA نسبت به اسپرمهای DNA سالم محاسبه میشود.در این شکل سبز شدن رنگ اسپرمها نشان دهندهی آسیب DNA میباشد(TUNEL مثبت) و اسپرمهای قرمز رنگ حاوی DNA سالم (TUNEL منفی) میباشند (شکل۴-۲).

شکل(۴-۲): ارزیابی آسیب DNA: A،در نمونه کنترل،B ، در نمونه آزمون با روش TUNEL با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت(۱۰۰۰×)
مقدار شاخص درصد DFI اندازهگیری شده و در جدول

دیدگاهتان را بنویسید