مقاله درمورد نگهداری و طول موج

جدول 2-18 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با EcoRI
2-7-5-2 الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا
Widget not in any sidebars

1. ابتدا میزان مناسبی از کلنی تازه رشد یافته مخمر را به درون ml200 محیط کشت مایع YPD تلقیح نموده و محیط را بر روی شیکر در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری میکنیم تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر (OD600nm) به 2/1-8/0 برسد.
2. محیط کشت فوق را در rpm5000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نموده و به میزان 2/0 برابر، بافر فسفات پتاسیم mM50 ولرم (C°37( با 5/7pH و سپس DTT 1مولار با غلظت نهایی mM25 به آن اضافه نمایید.
3. سلولها را به مدت 15 دقیقه در دمای C°37 قرار می دهیم.
4. سلول ها را با سانتریفوژ در rpm5000 به مدت 5 دقیقه جمع آوری نموده و دو بار با بافر STM (پیوست 7) درحالیکه سلولها بر روی یخ قرار دارند شستشو می دهیم (بار اول به صورت هم حجم و در مرحله دوم با نصف حجم اولیه).
5. رسوب سلولی نهایی را در 005/0 حجم اولیه از بافر STM حل کرده و این سوسپانسیون سلولی مستعد را در حجم های کم در دمای C°70- نگهداری میکنیم.
6. به منظور ترانسفورم نمودن سلولهای مستعد، سوسپانسیون های سلولی (حجم µl60) را بر روی یخ ذوب نموده و µg10- ng200 از مولکول DNA خطی شده را به آن اضافه میکنیم.
7. سپس سلولها به کووت الکتروپوریشن 2 میلی متری سرد منتقل می شوند.
8. بعد از خشک نمودن کووت آن را درون دستگاه الکتروپوریشن قرار داده و به آن پالسی با مشخصات 2 کیلوولت، 25 میکروفاراد و 200 اهم وارد مینماییم.
9. بلافاصله پس از وارد نمودن پالس، ml1 محیط کشت YPD به تیوب حاوی سلولها اضافه کرده و به مدت 1ساعت در دمای °C 37 در شیکر انکوباتور قرار می دهیم.
10. محیط را سانتریفوژ نموده (rpm5000, 5دقیقه( و سلولها را بر روی محیط کشت YPD جامد حاوی زئوسین با غلظت µg/ml400 کشت داده و به مدت 5-3 روز در دمای °C37 قرار میدهیم.
11. سلولهای رشد یافته در غلظت بالای زئوسین (µg/ml400)، به صورت ماتریکس بر روی پلیت حاوی 800 و سپس µg/ml1600 کشت داده شدند.
12. پس از گذشت مدت زمان لازم (3 روز) از کلونهای رشد یافته برای انجام PCR اختصاصی ژنهای کلون شده در وکتور بیانی استفاده گردید.
2-7-5-3 تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین
PCR اختصاصی ژن زئوسین بر روی کلونهای نوترکیب رشد یافته در مراحل قبل بر اساس پروتوکل 2-7-3-1 و جدول 2-13 انجام گردید.
2-7-6 بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا
2-7-6-1 کشت سلولهای مخمری
1. سلول مخمری تأیید شده با PCR ژن زئوسین و نیز سلول مخمری فاقد پلاسمید در ml5 محیط کشت BMGY (پیوست 1) کشت داده شده و بر روی شیکر در دمای С °30 با دور rpm200 قرار داده شد تا OD600 محیط به 6-2 برسد (حدود 18-16 ساعت).