مقاله درمورد روش انجام کار و آنتی ژن


Widget not in any sidebars
1) اولین تزریق:
• براساس غلظت نمونه پروتئینی مورد نظر (پروتئین GCSF نوترکیب موجود در بازار دارویی (ساخت شرکت پویش دارو)، l85 از ویال (200 میکروگرم) را برداشته و با l415 از PBS استریل مخلوط کرده و آن را با μl500 ادجوان کامل فروند مخلوط کرده و با emulsifier آنقدر این دو ماده را مخلوط کردیم تا شیری رنگ و سفت شد.
• قبل از اولین تزریق،ml 1 خون از حیوان گرفته شد تا به عنوان کنترل منفی (قبل از تزریق) از آن استفاده شود.
• این نمونه در rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گردید و سرم از گلبول های قرمز جدا گردید. سرم را در تیوب جدید ریخته و در 20- درجه سانتیگراد نگهداشتیم.
• محلول آماده شده از آنتی ژن در FCA به 8 جای مختلف از پشت خرگوش به صورت درون پوستی تزریق گردید.
2) دومین تزریق:
• سی روز پس از اولین تزریق، دومین تزریق به خرگوش باμl 85 از نمونه پروتئینی (200 میکروگرم) در μl415 PBS استریل با μl 500 ادجوان ناقص فروند مجدداً به صورت درون پوستی صورت گرفت.
• 30 روز بعد، ml1 خون از حیوان گرفته شد تا از نظر ایمنی زایی تزریقهای فوق با روش ایمونوبلاتینگ، مورد بررسی قرار بگیرد.
2-7-8 ایمونوبلاتینگ
برای شناسایی پروتئین های اختصاصی از طریق آنتی بادی های پلی کلونال یا مونو کلونال، از لکه گذاری ایمنی استفاده می شود. در روش لکه گذاری ایمنی نمونه های پروتئینی در حضور ماده SDS و عوامل احیاء کننده (مانند 2- مرکاپتواتانول) الکتروفورز شده و سپس از روی ژل به غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی منتقل می گردند و با استفاده از آنتی بادی های نشاندار شده شناسایی می شوند. برای انتقال پروتئین ها از ژل به غشاء از روش هایی مانند روش تانک و یا روش نیمه خشک استفاده می شود. در روش انتقال با تانک، از بافر حاوی تریس -گلایسین و متانول استفاده می شود که متانول علاوه بر اینکه از تورم ژل جلوگیری می کند، باعث جدا شدن SDS از پروتئین ها شده و بازده اتصال پروتئین به غشاء را افزایش می دهد. در روش انتقال نیمه خشک، ساندویچ انتقال پس از خیس شدن در بافر انتقال، بین دو الکترود بزرگ گرانیتی قرار گرفته و عمل انتقال انجام می گیرد (Sambrook, 2001).
در اینجا روش انتقال با روش نیمه خشک توضیح داده می شود.
مواد لازم
– غشاء نیتروسلولز با منافذ 45/0 میکرومتری
– کاغذ واتمن
– بافر انتقال (شامل تریس بازی، گلایسین، متانول و آب مقطر می باشد، پیوست 8).
– دستگاه Semidry
– رنگ پانسوS
روش انجام کار
• نمونه پروتئینی در مجاورت مارکر پروتئینی با روش SDS-PAGE، الکتروفورز شد.