دانلود پایان نامه درباره فرآورده های پروتئینی و مصرف کنندگان

‏ این روش تکثیری قدرتمند برای مشخص کردن جهش‌های نقطه‌ای است. در این روش از پرایمرهای جهش یافته و طبیعی در دو لوله جداگانه استفاده می‌شود. اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است و اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله‌ حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است. این روش نام‌های دیگری نیز دارد از جمله ‏MAMA-PCR‏ مخفف ‏Amplificatin Multation Assay‏ ‏Mismatch‏ و ‏COP-PCR‏ مخفف ‏Competitive Oligonucleotide Primming‏ (Lajin, Alachkar et al. 2012). ‏
1-6-2-1-الف-د-نستد پی سی آر (‏Nested-PCR‏)
Widget not in any sidebars

در این روش از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود، طوری که جفت دوم در جفت اول جای می‌گیرد. در این روش ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف در طول 30-15 چرخه تکثیر می‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌ای دیگر منتقل می‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف کوچکتری از ‏DNA‏ که درون ‏PCR‏ اولی است، به اندازه 40-15 چرخه تکثیر می‌شود.‏
مزایای این روش تغییر یافته ‏PCR‏ عبارت است از: 1) نیاز به پروب (کاوشگر) و تأییدهای بعدی کمتر است، 2) حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است و 3) به دلیل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جدید، ممانعت کننده‌ها رقیق می‌شود (Massung, Slater et al. 1998).
1-6-2-1-الف-ه-Real-Time PCR
به علت ورود نسل جدیدی از ترموسایکلرها با سیستم فلورومتری که اجازه پایش پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را می‌دهد، این روش ابداع شد. در این روش از کاوشگرها یا پروب‌های هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای 5 یا 3 استفاده می‌شود. که امکان پایش پیوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازی آن ها در روش‌های الکتروفورز در ژل آگارز یا ژل پلی آکریل آمید می‌دهد. این سیستم در سال 1992 کشف شد. این روش به دلیل کاهش زمان سیکل‌های ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و کاربرد نشانگرهای فلوروژنیک و روش‌های حساس آشکارسازی تابش آن ها باعث افزایش سرعت این سیستم نسبت به سیستم ‏PCR‏ معمولی شده است. سازندگان و کاربران این روش سعی می‌کنند محصول ‏PCR‏ کوچک‌تر طراحی کنند تا سرعت افزایش یابد اما تجربه نشان داده که کاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهینه نمی‌کند. البته این روش دارای معایبی نیز است از جمله می‌توان به عدم ناتوانی در مشخص کردن اندازه محصول بدون باز کردن سیستم و ناسازگار بودن برخی پلت فرم‌ها با شیمی برخی رنگ‌های فلورژنیک اشاره کرد (Dorak 2007).
1-7-پیشینه تحقیق
شناسایی گونه های حیوانی وگیاهی استفاده شده در فرآورده های پروتئینی مورد مصرف انسان و خوراک دام و طیور به لحاظ اقتصادی، عقاید مذهبی و بهداشتی بسیار حائز اهمیت می باشند. بیماری هایی چون جنون گاوی و آنفولانزای مرغی، سوء استفاده بعضی تولیدکنندگان مواد غذایی، دلایل مذهبی، حساسیت ها (آلرژی های) غذایی و غذاهای ترانس ژنتیک (GMOs) باعث افزایش نگرانی مردم در خصوص ترکیبات محصولات غذا یی شده است. گاهی اوقات برچسب محصولات غذایی تضمین کافی و درستی را از ترکیب واقعی خوراک ها نمی دهند، لذا لازم است روش هایی برای تعیین و تصدیق ترکیبات خوراک وجود داشته باشد تا هم مصرف کنندگان و هم تولید کنندگان در برابر تعویض و تقلبات غیر قانونی و تخلفات خاموش احتمالی حمایت گردند.
در این میان DNA میتوکندری به سبب برتری هایی که دارد، برای مطالعات تشخیص گونه و تشخیص تقلب در محصولات فرآوری شدۀ صنعتی و خوراک دام و طیور نسبت به DNAژنومی ارجح است. مطالعات نشان دهنده تکنیک های متعدد دیگری جهت بررسی صحت مواد غذایی گوشتی استفاده شده است (Tartaglia, Saulle et al. 1998).
1-7-1-پیشنه مطالعاتی در کشور ایران
جاهد خانیکی و همکاران در سال 1383 با توجه به تفاوت رنگ آمیزی بین بافت سویا و گوشت متوجه تقلبات شدند. در این مطالعه از یکی از رنگ آمیزی هایی که در آزمایشگاه های بافت شناسی معمول می باشد برای تشخیص تقلبات استفاده شد، این روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین است. در این ارتباط ۸۰ نمونه از همبرگرهای خام منجمد از فروشگاه های مواد غذایی خریداری شد. نمونه ها در شرایط مناسب به آزمایشگاه بافت شناسی ارسال شد. سپس نمونه برداری و آزمایش بافت شناسی با رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین انجام گرفت. در میکروگراف های تهیه شده، بافت سویا با رنگ قرمز مشاهده شد ولی سلول های لایه پالیسادینگ با رنگ روشن و دارای تلالوی خاصی دیده شدند. مواد پروتئینی داخل سلول های کوتیلدون سویا به رنگ قرمز و جدار کربوهیدارته سلول به رنگ آبی مشاهده شدند. بافت اکسترودات سیلندری که در واقع همان سلول های کوتیلدونی دناتوره شده می باشند رنگ قرمز تیره به خود گرفته است و با توجه به ساختمان بافتی که دارد به خوبی از بافت عضلانی متمایز می گردد. در تمام نمونه های آزمایش شده بافت سویا مشاهده شد. لذا با توسل به روش های هیستولوژیکی، تشخیص سویا در همبرگر و تفکیک آن از بافت عضلانی امکان پذیر است (خانیکی و نوری 1383).
در روشی مشابه صادقی و همکاران نیز جهت بررسی وجود بافت های غیر مجاز در انواع سوسیس و کالباس عرضه شده در مراکز توزیع شهر کرمانشاه در طی سال 1387 تا 1388 از رنگ آمیزی استفاده شد. این مطالعه از نوع توصیفی- مقطعی و حجم نمونه ی پژوهش 720 نمونه ی سوسیس و کالباس تهیه شده از مراکز توزیع شهر کرمانشاه بوده است که از نظر بافت های غیر مجاز مورد بررسی قرار
گرفته است. پس از نمونه گیری، تهیه ی مقاطع بافتی و رنگ آمیزی انجام شد. تشخیص بافت ها به کمک میکروسکوپ و توسط متخصصین بافت شناس انجام گرفت. عضله ی اسکلتی در 2/96 درصد از نمونه ها وجود داشت و در 8/3 درصد نمونه ها یافت نشد در 8/30 درصد نمونه ها بافت چربی مشاهده شد. در 2/19 درصد نمونه ها عضله قلبی یافت شد. در 2/96 درصد نمونه ها غضروف و استخوان بالغ یافت شد. در 6/57 درصد نمونه ها استخوان نابالغ یافت شد. فراوانی حضور هر یک از بافت های طحال، مری، آئورت، غدد بزاقی، غدد ترشحی لوله ی گوارش، گره لنفاوی، مو، ریه و زبان 8/3 درصد بود. فراوانی حضور هر یک از بافت های پستان، اپیدرم پوست و عصب 7/7 درصد بود. فراوانی حضور بافت همبند و عضلات صاف هر کدام 27 درصد بود. فراوانی حضور حفره های خالی و رگ هر1/46 درصد بود. در 100 درصد نمونه ها بافت های گیاهی تشخیص داده شد (صادقی، خزاعی و همکاران 1390).
حسینی و همکاران با روش الایزا تقلبات موجود در همبرگر را از نظر وجود گوشت های غیر مجاز و حرام بررسی نمودند. با توجه به گرانی گوشت و امکان انجام انواع تقلبات ازجمله استفاده از گوشت های ارزان قیمت در این مطالعه نوع گوشت مورد استفاده درتولید 288 نمونه همبرگرتولید شده در کارخانجات فرآورده های گوشتی و 96 نمونه همبرگر دست ساز غیر صنعتی عرضه شده در سطح شهر تهران درسال 1386 به روش الیزای ساندویچی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد در هیچ یک از نمونه های مورد آزمون از گوشت تک سمی وخوک در تولید محصول استفاده نشده است، ولی انواع اختلاط گوشت مرغ، گوسفند و گاو در نمونه ها مشاهده شد و 8/43 در صد نمونه های همبرگر صنعتی با فرمول پروانه ساخت و برچسب محصول مطابقت نداشتند (حسینی، برازندگان و همکاران 1388).
قوتی و همکارانش در مطالعه ای به شناسایی و ردیابی بقایای بافتی اسب سانان (اسب و الاق) در مواد غذایی و خوراک دام و طیور با استفاده از توالی Cytochrome-b پرداختند. بدین منظور از سوسیس، کالباس، گوشت چرخ کرده وپودر ماهی تولید کارخانه های مختلف به ترتیب تعداد 10، 10، 10 و 50 نمونه جمع آوری شد. استخراج DNA از نمونه ها به روش گوانیدین تیوسیانات – سیلیکاژل صورت گرفت. قطعه 144 جفت بازی از ناحیه Cytochrome-bتوالی DNA میتوکندری با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز و جفت آغازگر اختصاصی اسب سانان تکثیر شد. نتایج نشان دادند که نمونه های جمع آوری شده هیچگونه آلودگی به بقایای بافتی اسب سانان نداشتند (قوتی، نصیری و همکاران 1387).
در مطالعه ای دیگر قوتی رودسری و همکارانش به تشخیص تقلب در پودر ماهی با استفاده از توالی های ژنی 12 S rRNAو16 S rRNAاز DNA میتوکندری پرداختند. بدین منظور از پودر ماهی تولید کارخانه های مختلف تعداد 20 نمونه جمع آوری شد. استخراج DNAاز نمونه ها به روش گوانیدین تیوسیانات- سیلیکاژل صورت گرفت. قطعات 104، 183 و 290 جفت بازی به ترتیب برای نشخوار کنندگان (گاو، گوسفند و بز)، طیور (مرغ و بوقلمون) و خوک سانان (اهلی و وحشی) از نواحی ژنی 12S rRNAو 16S rRNA، DNA میتوکندریایی با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز به صورت Multiplex و آغازگرهای اختصاصی نشخوار کنندگان، طیور و خوک سانان تکثیر شد. نتایج نشان دادند که نمونه های پودر ماهی جمع آوری شده هیچگونه آلودگی به بقایای بافتی خوک سانان نداشتند. اما 75 درصد نمونه های جمع آوری شده آلودگی به بقایای بافتی نشخوارکنندگان و 55 درصد آلودگی به بقایای بافتی طیور را نشان دادند. همچنین میزان آلودگی مشترک بقایای بافتی نشخوار کنندگان و طیور در پودر ماهی 45 درصد برآورد شد (رودسری، نصیری و همکاران 1387).
پیرانی و همکارانش با استفاده از ژن سیتوکروم b میتوکندری به تشخیص همزمان گوشت گاو، گاومیش، گوسفند و بز به روش Multiplex-PCR پرداختند. در این تحقیق نمونه های گوشت از گونه های فوق الذکر جمع آوری شده و آسیاب گردید. استخراج DNA از ۲۵۰ میلی گرم گوشت هر نمونه انجام شد و کمیت و کیفیت آن به روش های مشاهده بر روی ژل و تست با اسپکتروفتومتر بررسی گردید. برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز، آغازگرهایی طراحی شد که برای هر گونه قطعه متفاوتی از ژن سیتوکروم b تکثیر گردد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز به صورت جداگانه و همچنین به طور همزمان با مخلوطی از آغازگرها انجام شد. نواحی تکثیر شده بر روی ژل آگارز ۲% الکتروفورز شده سپس توسط اتیدیوم برماید رنگآمیزی شده و نوارهای الگو بدست آمد. در این تحقیق نوارهای ۱۲۴،330، ۴۷۲ و ۵۸۵ جفت بازی به ترتیب نشانگر گونه های گاومیش، بز، گاو و گوسفند بود. تکثیر ناحیه مورد نظر از هر گونه بیانگر وجود گوشت آن گونه در مخلوط گوشت و یا فرآورده های پروتئینی بود (پیرانی و زرین قبایی ۱۳۸۸).
پرچمی نژاد در مطالعه ای از روش مولکولی جهت شناسایی گونه های گوشتی در سوسیس های صنعتی استفاده کردند. در این بررسی، از 10 نمونه سوسیس تولید شده از گوشت گاو در سطح استان تهران ‏نمونه برداری شد و پس از استخراج DNA از نمونه های گوشت خام (بز، الاغ، شتر، گاو و مرغ ‏) و سوسیس ها با آغازگرهای اختصاصی هر گونه آزمایش PCR‏ بر روی آن ها انجام گردید. نتایج حاصل از Multiplex PCR‏ ‏نمونه ها حاکی از این بود که در تمام نمونه های سوسیس، اجزای مرغ وجود دارد و فقط در 5 نمونه سوسیس علاوه بر اجزای مرغ، بقایای گوشت گاو هم مشاهده گردید. ولی نتایج توالی یابی نشان داد که در تمام نمونه ها گونه Gallus gallus jabouillei‏ وجود دارد و فقط در سه نمونه نتیجه توالی یابی به صورت multiple گزارش شد، یعنی گونه دیگری هم در آن وجود داشت که به وسیله توالی یابی مشخص نش
د (پرچمی نژاد 1391).
1-7-2-پیشینه مطالعاتی در کشورهای دیگر
Koh و همکارانش از روش ایمنی-شیمیایی برای شناسایی و اندازه گیری کمّی گوشت پخته و خام و پروتئین سویا در مخلوط های گوشتی استفاده کردند. آنها از آنتی بادی های ویژه خرگوش بر علیه پروتئین های سویای renatured و پروتئین های ماهیچه اسکلتی گاو استفاده نمودند (Koh 1978).
یکی از اولین تحقیقاتی که برای شناسایی پروتئین های سویا در مخلوط های گوشت و سویا مورد استفاده قرار گرفت روش ساده و حساس آنزیماتیک بود که توسط Morrissey و همکارانش معرفی شد. در این روش مخلوط گوشت-سویا با اسید رقیق دستخوش هیدرولیز اسیدی می شدند و در حضور گالاکتوز-دهیدروژناز، گالاکتوز و آرابینوز حاصل می گردید که میزان این دو قند در اشکال مختلف آرد و کنسانتره و ایزوله µM/1g 66 به بالاست در حالی که در گوشت گاو و خوک این کمتر از µM/1g 1 از محصول خام است. این روش برای اندازه گیری کیفی سویا در فرآورده های گوشتی مناسب است. حرارت دهی ˚c 100 در مدت زمان بالای 60 دقیقه باعث افت آزاد شدن گالاکتوز و آرابینوز گردید (Morrisey, Olbrantz et al. 1982).