اندازه گیری و استاندارد


Widget not in any sidebars

MDA (µmol/g FW)= [A532-A600/155]×1000
3-8-7- اندازهگیری رنگیزههای کلروفیل و کاروتنوئید
برای اندازهگیری رنگیزههای کلروفیل و کاروتنوئید، از روش Lichtenthaler and Wellburn (1985) استفاده شد. 1/0 گرم از وزن تر برگ به همراه 5 میلی لیتر استون 80 درصد در هاون چینی ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 10 دقیقه در 2500 دور، سانتریفیوژ شد. سپس جذب فاز بالایی هر یک از نمونههای سانتریفیوژ شده توسط اسپکتروفتومتر در طول موجهای 662 نانومتر، 645 نانومتر و 470 نانومتر اندازهگیری شد. برای محاسبه کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید از فرمولهای زیر استفاده شد:
Chl a = 11.75 A662 – 2.350 A645
Chl b = 18.61 A645 – 3.960 A662
Car =1000 A470 – 2.270 Chl a- 81.4 Chl b /227
در این رابطه Chl a، Chl b و Car به ترتیب غلظت کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید می باشد (A میزان جذب خوانده شده در هر طول موج توسط اسپکتروفتومتر میباشد).
3-8-8- اندازهگیری گلایسین بتائین
برای اندازهگیری گلایسین بتائین از روش Greive and Grattan (1983) استفاده گردید. ابتدا نمونههای گیاهی را در دمای 80 درجه به مدت 72 ساعت خشک نموده 5/0 گرم از برگ را توزین کرده و آن را در ارلن ریخته و 20 میلی لیتر آب دیونیزه به آن اضافه گردید و به مدت 24 ساعت در دمای 25 درجه سلسیوس روی شیکر قرار داده شد. سپس نمونهها از کاغذ صافی عبور داده شدند.
پس از تهیه اسید سولفوریک 2 نرمال (2N)، 1 میلیلیتر از عصاره گیاهی را با 1 میلی لیتر اسید، مخلوط (به نسبت 1:1) و سپس مقدار 5/0 میلی لیتر از ترکیب حاصله را در لوله آزمایش ریخته و در حمام آب یخ به مدت 1 ساعت قرار داده و نهایتا پس از تهیه مخلوط ید و یدید پتاسیم (7/15 گرم ید خالص به علاوه 20 گرم یدید پتاسیم) مقدار 2/0 میلیلیتر از یدید پتاسیم و ید را به لوله آزمایش اضافه کرده و آن را ورتکس می نمائیم. در این مرحله نمونهها به مدت 16 ساعت در دمای صفر تا 4 درجه سلسیوس نگهداری گردیدند. بعد از آن نمونهها به مدت 15 دقیقه در دمای صفر درجه سلسیوس با میزان دور 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. در هر لوله آزمایش، فاز محلول رویی جدا و فقط کریستال موجود در کف لوله نگه داشته شد. این مراحل حتما بایستی در محیط حمام آب یخ انجام شود تا خطای آزمایش کاهش یابد. سپس کریستالهای موجود را در 9 میلی لیتر از محلول 1 و 2 دی کلرو اتان حل کرده و پس از عمل ورتکس و طی زمان 2 ساعت، مقدار جذب آن در طول موج nm 365 اندازه گیری شد.
3-8-9- اندازهگیری پروتئین کل
برای تعیین میزان پروتئین محلول کل از روش برادفورد استفاده شد. برای این منظور 100 میلی گرم کومایسی بلو را با 50 میلی لیتر اتانول 95 درصد حل نموده سپس با اضافه نمودن 100 میلی لیتر اسید فسفریک 85 درصد به حجم 1 لیتر رسانیده و از کاغذ صافی عبور داده شد. برای تهیه محلول استاندارد از آلبومین سرم گاوی استفاده شد. در داخل سلهای یک بار مصرف 5/2 میلی لیتر از محلول کومایسی بلو آماده شده ریخته شد و سپس 100 میکرولیتر عصاره برگی از هر نمونه داخل یک سل اضافه شد و نهایتا میزان جذب نمونهها و محلولهای استاندارد با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 595 نانومتر قرائت شد (Bradford, 1976).
3-9- اندازهگیری فعالیت آنزیم ها
3-9-1- استخراج عصاره گیاهی برای سنجش فعالیت آنزیم ها
برای تهیه عصاره گیاهی جهت تعیین میزان فعالیت آنزیمهای کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز از روش Kang و Saltiveit (2001) با اندکی تغییرات استفاده شد. 5/0 گرم وزن تر برگ از کلیه تیمارها توزین و سپس به داخل هاون سرد منتقل شد و توسط 3 میلی لیتر محلول بافر تریس با 5/7=pH (شامل اسید کلریدریک 05/0 مولار، 3 میلی مولار کلرید منیزیم و 1 میلیمولار EDTA) با دسته هاون خوب ساییده شد. بافر استخراجی برای اندازهگیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز شامل 2/0 میلیمولار آسکوربات نیز بود. هموژن حاصل به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سلسیوس با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی حاصله به عنوان عصاره خام برای اندازه گیری فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان مورد استفاده قرار گرفت.
3-9-2- اندازهگیری فعالیت کاتالاز(CAT, EC 1.11.1.6)
فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از روش Aebi (1984) اندازه گیری شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلیلیتر بافر فسفات 50 میلی مولار (7=pH) شامل 2/0 میلی لیتر پراکسید هیدروژن 1 درصد و 3/0 میلیلیتر عصاره استخراجی بود. سپس فعالیت آنزیم کاتالاز به صورت کاهش در جذب طی 1 دقیقه در طول موج 240 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر محاسبه شد. برای سنجش فعالیت کاتالاز از ضریب خاموشی (mM-1 Cm-16/43) استفاده شد.
3-9-3- اندازهگیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX, EC 1.11.1.1)
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در تمام تیمارها و تکرارها با استفاده از روش Nakano و Asada (1981) با اندکی تغییرات اندازهگیری شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلی لیتر بافر فسفات 50 میلیمولار (7=pH) شامل EDTA 1/0 میلیمولار، آسکوربات سدیم 1 میلیمولار، 2/0 میلیلیتر پراکسید هیدروژن 10 میلیمولار و 1/0 میلیلیتر عصاره استخراجی بود. سپس فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز به صورت کاهش در جذب طی 1 دقیقه در طول موج 290 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر محاسبه شد. برای سنجش فعالیت آسکوربات پراکسیداز از ضریب خاموشی ( mM-1 Cm-18/2) استفاده شد.
3-9-4- اندازهگیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX, EC 1.11.1.7)
فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز با استفاده از روش Updhyaya و همکاران (1985) انجام گرفت. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلیلیتر بافر فسفات 50 میلی مولار (7=pH) شامل 1 میلیلیتر گایاکول 1 درصد، 1 میلیلیتر پراکسید هیدروژن 1 درصد و 1/0 میلی لیتر عصاره استخراجی بود. سپس فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز به صورت افزایش در جذب طی 1 دقیقه در طول موج 420 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر محاسبه شد. برای سنجش فعالیت گایاکول پراکسیداز از ضریب خاموشی ( mM-1 Cm-16/26) استفاده شد.
3-10- اندازهگیری عناصر برگ و ریشه
3-10-1- استخراج عصاره گیاهی جهت اندازهگیری کلر، سدیم، پتاسیم و نیترات
برای این منظور، 100 میلی گرم از ماده خشک پودر شده ریشه و برگ به طور جداگانه از کلیه تیمارها توزین گردید و در لولههای آزمایش ریخته شد. سپس به هر یک از لولهها 10 میلیلیتر آب مقطر اضافه شد. این لولهها به مدت 1 ساعت در بن ماری جوشان حرارت داده شدند. پس از خنک شدن در دمای اتاق به مدت 20 دقیقه در دور g 5000 سانتریفیوژ شدند. محلول رویی به لوله آزمایش جدید، منتقل و دوباره با آب مقطر به حجم 10 میلیلیتر رسانده شد. این محلول به عنوان عصاره خام برای اندازهگیری میزان عناصر مورد استفاده قرار گرفت.